血液科

真性紅細(xì)胞增多癥（Polycythemia vera,PV），簡稱真紅，是一種造血干細(xì)胞疾病，是以JAK2V617F突變或JAK2 12號(hào)外顯子突變導(dǎo)致的紅系增生為主伴有粒系和巨核系均增生為主要特征的慢性骨髓增殖性疾病，在2008年WHO的慢性骨髓增殖性腫瘤的分類中與原性性血小板增多癥（Essential thrombocythemia，ET）和原發(fā)性骨髓纖維化（Primary myelofibrosis ，PMF）一起被歸納為Bcr/abl陰性的慢性骨髓增殖性疾病。臨床以紅細(xì)胞數(shù)及血容量顯著增多，伴中性粒細(xì)胞及推動(dòng)力小板升高為特征，出現(xiàn)多血質(zhì)及高粘滯血癥所致的一系列癥狀和體征，常伴有脾大和皮膚瘙癢，其起病隱匿，病程長，晚期可發(fā)生各種轉(zhuǎn)化。早在1892年Vaquz就報(bào)道了一例以持續(xù)性血細(xì)胞增多并伴有發(fā)紺的病例。1904年Turk首先提出了PV早期即同時(shí)伴有粒及巨核細(xì)胞系增生。1951年Dameshek將PV、ET、PMF和慢性粒細(xì)胞白血癥（Chronic Myeloid Leukemia ，CML）等疾病歸類為一類相關(guān)性疾病并稱之為慢性骨髓增殖性疾病。一、 發(fā)病的概況PV是一種少見的疾病，但并非罕見疾病，大多發(fā)生在中老年人，平均發(fā)病年齡在50－60歲，男性多于女性，各國均有發(fā)病，發(fā)病率較的國家和地區(qū)有以色列猶太人、日本長崎和瑞典哥德堡。以色列猶太人的發(fā)病率：男1.3/10萬人，女0.5/10萬人；日本長崎：男1.6/10萬人，女0.4/10萬人；瑞典哥德堡：1.4/10萬人。我國于1957年首次有報(bào)告，文獻(xiàn)報(bào)道的平均發(fā)病年齡為53歲，但由于缺乏該病的普查資料，我國暫無發(fā)病率的報(bào)道。二、 病因和發(fā)病機(jī)制雖然PV的病因至今不明，但眾多的實(shí)驗(yàn)資料表明，PV患者具有以特點(diǎn)：1、發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)是發(fā)生在多能造血祖細(xì)胞水平，且轉(zhuǎn)化型的造血祖細(xì)胞超過了非轉(zhuǎn)化型的造血祖細(xì)胞而占主導(dǎo)地位；2、在無特定的刺激條件下，能過度產(chǎn)生一種或多種血細(xì)胞；3、在體外有自發(fā)性集落形成的能力；4、骨髓增生極度活躍，巨核細(xì)胞增生活躍或增生不良；5、主要的細(xì)胞遺傳學(xué)改變累及到1、8、9、13和20號(hào)染色體；6、病人主要的死亡原因?yàn)槌鲅把ㄐ纬桑?、髓外造血旺盛；8、有自發(fā)性向急性白血病和骨髓纖維化轉(zhuǎn)變的傾向。在2005年，國際上4個(gè)不同的研究組幾乎在同一時(shí)期在不同的國際著名醫(yī)學(xué)期刊報(bào)道了在PV患者中超過90%患者存在著JAK2V617F突變，這一“里程碑”式的發(fā)現(xiàn)對(duì)于闡明MPDS發(fā)病的分子機(jī)制，開拓了新的視野。JAK2是一種非受體胞漿酪氨酸激酶，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)來自各種細(xì)胞因子和生長因子受體的信號(hào)，在髓系發(fā)育中起重要作用。JAK2的結(jié)構(gòu)模型提示V617至E621殘基形成一個(gè)環(huán)，連結(jié)假激酶區(qū)域N端突起的兩條β鏈，C618接觸活化環(huán)。V617、C618和其它一些局部殘基可抑制激酶活化環(huán)從非活化構(gòu)象向活化構(gòu)象移動(dòng)（即，V617區(qū)域在負(fù)性調(diào)節(jié)JAK2信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)發(fā)揮直接作用）。大型的芳香氨基酸苯丙氨酸替代纈氨酸，很可能破壞這種負(fù)性調(diào)節(jié)，這也可以從分子基礎(chǔ)上解釋為什么PV患者的紅系祖細(xì)胞在體外培養(yǎng)能自發(fā)性形成集落，以及骨髓增殖性疾病患者的紅系祖細(xì)胞和髓系祖細(xì)胞對(duì)幾種不同的生長因子特別敏感,但是對(duì)于JAK2V617F突變陰性患者的發(fā)病分子基礎(chǔ)則有待于進(jìn)一步研究。三、 病理PV病變主要累及骨髓、脾、肝。骨髓內(nèi)紅髓明顯增多，而脂肪組織相對(duì)較少。骨髓結(jié)構(gòu)仍基本正常，紅系增生極為明顯，粒及巨核系常同時(shí)增生，也可其中之一系增生，部分患者僅紅系單獨(dú)增生。幼紅細(xì)胞在靜脈竇旁呈島狀增生，各階段粒細(xì)胞在小梁旁及血管周圍彌漫性增生，巨核細(xì)胞在小梁間區(qū)增生。骨髓增生的細(xì)胞呈高度異型性，血竇擴(kuò)張顯著。骨髓儲(chǔ)鐵細(xì)胞及鐵顆粒明顯減少，約80%的患者鐵染色陰性。病程后期，成纖維細(xì)胞及血管明顯增生，同時(shí)出現(xiàn)大紅細(xì)胞島，伴不成熟粒細(xì)胞和異型巨核細(xì)胞。網(wǎng)狀纖維染色示網(wǎng)狀纖維高度增生，預(yù)示將轉(zhuǎn)化或伴有骨髓纖維化。根據(jù)骨髓病理檢查，將PV分為三期：紅細(xì)胞增生期(此期骨髓造血功能活躍，紅系細(xì)胞過度增生并伴有白細(xì)胞和血小板增多)；穩(wěn)定期(此期全血細(xì)胞維持在正常范圍，這種變化并非由于病變的骨髓造血功能轉(zhuǎn)變正常，而是骨髓被異常增生的纖維組織所替代，而骨髓造血功能較前減低的結(jié)果)；骨髓衰竭期(此期骨髓纖維組織增生加劇，使髓內(nèi)造血組織減少并產(chǎn)生髓外造血)。早期腫大的脾其脾竇顯著擴(kuò)張、充血，紅系細(xì)胞增多，伴少量幼稚紅細(xì)胞。晚期可出現(xiàn)三系造血細(xì)胞，類似髓樣化生。腫大的肝臟其肝竇也擴(kuò)張，同時(shí)伴有髓樣化生。上述肝、脾在病理改變也是導(dǎo)致門靜脈高壓及頻發(fā)上消化道出血的病理基礎(chǔ)。如較大血管內(nèi)有血栓形成時(shí)，相應(yīng)臟器可見梗塞灶。其它器官通常無明顯病理變化。四、 臨床表現(xiàn)起病隱匿，通常在血常規(guī)檢查時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，有的患者出現(xiàn)并發(fā)癥如血栓形成或出血后才被確診。1、神經(jīng)癥狀 包括頭痛、頭暈、四肢脹痛和麻木、感覺障礙、視力下降、耳鳴OEMS綜合癥。嚴(yán)重時(shí)有意識(shí)障礙，甚至癡呆。上述癥狀和血粘度升高、血小板增多及腔隙性腦梗塞有關(guān)。2、多血癥狀 表現(xiàn)為結(jié)膜充血、面紅、唇紫、舌暗紅及血管怒張等。是由于紅細(xì)胞過多、血粘滯度高、血流緩慢和組織缺氧，導(dǎo)致微循環(huán)及全身血管充血與擴(kuò)張。3、出血 常見有牙齦出血、鼻出血，也可出現(xiàn)皮膚淤斑及胃腸道出血，少數(shù)患者并發(fā)腦出血。出血的原因大致有：血管過度擴(kuò)張及血液淤滯導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、血小板功能異常、不適當(dāng)使用非甾體鎮(zhèn)痛藥物導(dǎo)致血小板功能受損4、脾大 通常為輕至中度腫大，晚期伴有骨髓纖維化時(shí)脾大可達(dá)盆腔。5、血栓形成 為最常見的并發(fā)癥，約在1/3的患者中發(fā)生，以腦血栓形成最常見，其次為心臟冠狀動(dòng)脈、下肢深靜脈及脾受累少數(shù)可出現(xiàn)四肢動(dòng)脈血栓形成。文獻(xiàn)報(bào)道PV是肝靜脈血栓形成（Budd-Chiar綜合癥）的重要原因之一，約占10%。血小板明顯增多時(shí)，還可并發(fā)紅斑性肢痛癥，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生肢端紫紺，甚至壞疽。6、皮膚瘙癢 國外報(bào)道皮膚瘙癢是PV的重要臨床癥狀，皮膚痛癢發(fā)生率高達(dá)65.3%，作者觀察了38例PV患者有14例出現(xiàn)皮膚瘙癢癥狀，且JAK2V617F突變陽性的PV與JAK2V61 7F突變陰性的PV之間無明顯差異。皮膚瘙癢癥狀可以在PV診斷之前發(fā)生，也可以PV確診以后發(fā)生。PV相關(guān)的皮膚瘙癢常被描述為在皮膚與水接觸后出現(xiàn)的全身皮膚瘙癢、麻木、燒灼樣或針刺樣感覺，常被歸為水性瘙癢（aquagenic pruritus，AP）除了皮膚與水接觸后可以誘發(fā)瘙癢外，氣溫突然變化、烤火、鍛煉后出汗、飲酒或使用熱被褥均能誘發(fā)。其原因是由于肥大細(xì)胞在真皮層廣浸潤有關(guān)，也有作者認(rèn)為PV相關(guān)的AP與缺鐵和生物胺有關(guān)。有報(bào)道JAK2V617F突變陽性純合子的PV患者皮膚瘙癢癥發(fā)生率高達(dá)69%。7、其它 部分患者可并發(fā)Sweet綜合癥。PV患者由于骨髓細(xì)胞呈高代謝狀態(tài)，核蛋白分解加速而致高尿酸血癥，故臨床痛風(fēng)發(fā)作常見。五、實(shí)驗(yàn)室檢查1、血常規(guī)外周血三系細(xì)胞增加，血色深而稠，血相對(duì)密度為1.075~1.080。紅細(xì)胞≥6~10×109/L,血紅蛋白≥180~240g/L,血細(xì)胞比容0.55~0.80，網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；蛏愿?，可見紅細(xì)胞大小不等，多染性及有核紅細(xì)胞，晚期可見到異形紅細(xì)胞及大量的淚滴形紅細(xì)胞，提示并發(fā)骨髓纖維化。紅細(xì)胞壽命早期正常，以后縮短，少數(shù)患者HbF可增高。2/3患者白細(xì)胞數(shù)增高，大多數(shù)為12~15×109/L，少數(shù)超過50×109/L，并有核左移及少數(shù)中、晚幼粒細(xì)胞出現(xiàn)。中性粒細(xì)胞NAP積分增高者占70%，粒細(xì)胞化學(xué)發(fā)光對(duì)某些拮抗劑如白細(xì)胞三烯的反應(yīng)顯示為選擇性抑制異常。半數(shù)患者血小板計(jì)數(shù)在450~800×109/L，可見大型、巨型血小板，血小板對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)異常，甚至缺如，血栓烷A2的產(chǎn)生和代謝分泌均增加，但對(duì)血小板活化因子刺激后的結(jié)合力減弱，血小板受體的表達(dá)減弱。2、骨髓象骨髓呈增生活躍或明顯活躍，以紅系增生為主，常同時(shí)伴有粒及巨核細(xì)胞系增生。各系的各期細(xì)胞比例正常。鐵染色示細(xì)胞內(nèi)、外鐵均減少，甚至消失。骨髓活檢顯示前述病理改變，有助于診斷。3、紅細(xì)胞容量用核素51Cr標(biāo)記法測定紅細(xì)胞容量，PV患者均明顯升高。該項(xiàng)檢查是確診紅細(xì)胞增多的重要指標(biāo)，重復(fù)性高。并發(fā)門靜脈高壓時(shí)，因血漿容量增加，可造成RBC、Hb及HCT正常的假象，缺鐵時(shí)也可發(fā)生類似現(xiàn)象。此時(shí)檢查紅細(xì)胞容量則可確診。4、染色體骨髓染色體核型分析約25~35%患者有各種獲得性異常，其中以8號(hào)、9號(hào)染色體三體最常見，其它有20q-、11q-及13q-。經(jīng)化療、放療，或病情進(jìn)展后可出現(xiàn)5q-、7q-等異常。診斷時(shí)即有細(xì)胞遺傳學(xué)異常者，預(yù)后差。5、分子生物學(xué)幾乎所有PV患者骨髓幼紅細(xì)胞內(nèi)抗凋亡因子如Bcl-XL（B-cell leukemia-XL）表達(dá)增高,STAT3或STAT5過度活化。近幾年研究表明，95%以PV患者存在著JAK2V617F突變。6、其它血流變學(xué)檢查，顯示血粘度明顯升高，血沉減慢。各項(xiàng)凝血及纖溶指標(biāo)大多正常，但有報(bào)告抗凝血酶、蛋白C、蛋白S降低，及存在蛋白C抵抗，提示抗凝活性下降。約40%患者由于從粒細(xì)胞中釋放增多，血清維生素B12顯著升高。葉酸及鐵蛋白常減少。血尿酸、LDH升高。血?dú)夥治鍪狙躏柡投日?。血清EPO水平降低。體外骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)，BFU-E生長常無需EPO存在。超聲心動(dòng)圖檢查顯示77%的PV患者有主動(dòng)脈瓣或二尖瓣病變?nèi)绨昴ぷ兒瘛①樕?，此為血栓栓塞性并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)之一。六、 診斷2002WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)：A標(biāo)準(zhǔn)：1、紅細(xì)胞數(shù)目較正常平均值增高25%，或男性血紅蛋白＞18.5g/L,或女性＞16.5g/L 。 2、無繼發(fā)性紅細(xì)胞增多的原因，包括： ⅰ、缺氧（動(dòng)脈動(dòng)氧分壓≤92%； ⅱ、高氧結(jié)合力的血紅蛋白； ⅲ、截短的促紅細(xì)胞生成素受體； ⅳ、由于腫瘤所產(chǎn)生的過量的促紅細(xì)胞生成素。 3、脾臟腫大 4、在骨髓細(xì)胞中除外Ph染色體或BCR-ABL融合基因以外的克隆性遺傳學(xué)異常 5、內(nèi)源性紅系集落形成B標(biāo)準(zhǔn)：1、 血小板＞400×109/L2、 白細(xì)胞＞12×109/L3、 骨髓活檢示全骨髓增生活躍，以紅系和巨核系增生更為顯著4、 血清促紅細(xì)胞生成素濃度低 符合上述A標(biāo)準(zhǔn)的第1、2條，或者A標(biāo)準(zhǔn)的其它任何一條加上2個(gè)B標(biāo)準(zhǔn)即可以診斷。國內(nèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)：⑴臨床：A、多血質(zhì)表現(xiàn)；B、脾腫大；C、高血壓，或病程中有過血栓形成。⑵實(shí)驗(yàn)室：A、血紅蛋白≥180g/L(男)或≥170g/L（女），紅細(xì)胞數(shù)≥6.5 ×1012/L（男）或≥6×1012/L（女）；B、紅細(xì)胞容量＞39ml/kg（男）或＞27ml/kg（女）；C、血細(xì)胞比容≥0.54（男）或≥0.5（女）；D、無感染及其它原因白細(xì)胞多次＞11×109/L；E、血小板多次＞300×109/L；F、外周血中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色積分＞100；G、骨髓增生明顯活躍或增生活躍，粒、紅、巨核細(xì)胞三系均增生，尤以紅系為。⑶能除外繼發(fā)性或相對(duì)性紅細(xì)胞增多癥。具有上述⑴類任何2項(xiàng)，加⑵類中A、B二項(xiàng)，再加⑶類可診斷為PV。如無檢查紅細(xì)胞容量條件時(shí)，⑵類中A及有C至G中任何4項(xiàng)，再加⑶類也可診斷。近年來由于JAK2V617F突變的發(fā)現(xiàn)，目前國外出現(xiàn)了分子診斷標(biāo)準(zhǔn)，首先作Bcr/abl檢測確認(rèn)為Ph陰性的慢性骨髓增殖性疾病，然后作JAK2V617F檢測將PV分為JAK2V617F突變陽性和JAK2V617F突變陰性二大類，其診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：JAK2陽性的真性紅細(xì)胞增多癥（需要以下二條）A1：紅細(xì)胞壓積增高（男性＞52%，女性＞48%），或者紅細(xì)胞計(jì)數(shù)增加（＞正常25%）;A2：有ＪＡＫ２突變；JAK2陰性真性紅細(xì)胞增多癥（符合A1、A2、A3或者任何一個(gè)A標(biāo)準(zhǔn)加上二個(gè)B標(biāo)準(zhǔn)可以認(rèn)斷）A1：紅細(xì)胞增加（大于正常25%）或者紅細(xì)胞壓積在男性≥60%，女性＞56%；A2：無JAK2突變依據(jù)；A3：無繼發(fā)性紅細(xì)胞增多的因素（動(dòng)脈氧飽和度正常，血清Epo在正常水平）；A4：可觸及的脾臟腫大；A5：在造血細(xì)胞上有獲得性細(xì)胞遺傳學(xué)的異常（除外BCR-ABL）;B1: 血小板增多（＞450×109/L）；B2：中性粒細(xì)胞增多（中性粒細(xì)胞＞10×109/L，在吸煙者＞12.5×109/L）;B3: 在放學(xué)線上有脾臟腫大；B4：有內(nèi)源性紅系集落形成或者血清Epo濃度較低。七、 鑒別診斷PV必須和繼發(fā)性及相對(duì)性紅細(xì)胞增多癥鑒別。繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥是由于長期慢性缺氧致EPO升高，刺激骨髓紅系過度反應(yīng)所致。常見于右至左分流的先天性心臟病、慢性阻塞性肺病、氧親合國過高或攜氧能力減低的異常血紅蛋白病。此外，腎積水、腎囊腫、腎腫瘤因壓迫腎組織，使局部血流減少而刺激EPO產(chǎn)生過多，致紅細(xì)胞生成增多。相對(duì)性紅細(xì)胞增多癥又稱良性或假性紅細(xì)胞增多癥，是由于血漿容量減少所引起，并非真正的紅細(xì)胞增多。部分患者紅細(xì)胞增多為暫時(shí)性，如持續(xù)嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、大量出汗、大面積燒傷等造成脫水或組織液減少。此時(shí)外周紅細(xì)胞呈一過性增多，后隨原發(fā)病控制而很快恢復(fù)正常，另有少數(shù)患者和吸煙、焦慮、肥胖等有，去 除誘因右恢復(fù)正常。但其中少數(shù)患者也可并發(fā)血栓性并發(fā)癥，少數(shù)可發(fā)展為PV。八、 治療除了異基因造血干細(xì)胞移植的零星報(bào)道，目前尚無治療可根除異?？寺　Ｒ虼薖V的治療目的包括：抑制骨髓紅系細(xì)胞異常喪生、降低血容量、減少血粘度、消除紅細(xì)胞增多所致的各種癥狀和體征、減少血栓栓塞及出血性并發(fā)癥、提高生活質(zhì)量并延長生存期。低危血栓形成患者（小于60歲、無血栓病史）可能不需要額外治療。對(duì)高危血栓（超過60歲或有血栓史）或?qū)o脈放血要求很高的患者，根據(jù)年齡給予骨髓抑制性治療，70歲以上的年老患者可給予32P或白消安；年輕患者可以選擇羥基脲。（一）靜脈放血使血細(xì)胞比容保持在安全水平（小于0.45）為基本的、安全有效的治療方法，可以減少血栓形成和出血的危險(xiǎn)性。一般每次放血300~500ml，間隔1~3日，至亂轉(zhuǎn)細(xì)胞比容達(dá)到正常范圍。老年人及有心血管疾患者，每次放血200~300ml。此法簡便、安全，能緩解與血容量及高粘滯度有關(guān)的癥狀，但不能改善肝脾腫大、皮膚瘙癢及痛風(fēng)的癥狀，不能控制白細(xì)胞和血小板數(shù)量，仍可形成血栓，反復(fù)放血可引起缺鐵，但禁用鐵劑。為防止放血后血栓形成，放血后可靜脈輸注低分子右旋糖酐500ml。由于PV患者血液粘稠，應(yīng)用傳統(tǒng)的采血袋放血常難以達(dá)到放血治療的要求，近年來，由于全自動(dòng)血細(xì)胞分離機(jī)在臨床上廣泛應(yīng)用，應(yīng)用血細(xì)胞分離機(jī)對(duì)PV患者進(jìn)行治療性紅細(xì)胞分離單采術(shù)，可快速、有選擇性、有效地減少患者血循環(huán)中病理細(xì)胞含量，迅速緩解高粘滯血癥。單采1~2次右獲明顯效果，不良反應(yīng)為大量抗凝劑進(jìn)入體可造成低亂轉(zhuǎn)癥。（二）放射性核素32P32P為放射性核素，能釋放β射線進(jìn)行選擇性內(nèi)照射，抑制核分裂，達(dá)到抑制骨髓造血的目的。由于異?？寺〖?xì)胞的代謝旺盛，對(duì)射線敏感，攝取32P較正常細(xì)胞多。適用于癥狀明顯、羥基脲治療無效者，不愿意定期服藥者，發(fā)病年齡在70以或有出血和血栓形成者，放血后可用32P鞏固。如白細(xì)胞和血小板數(shù)正常，而癥狀明顯時(shí)，應(yīng)慎用。白細(xì)胞及血小板數(shù)低于正常、嚴(yán)重肝腎疾病、腦出血急性期、活動(dòng)性肺結(jié)核、妊娠及哺乳期均為禁忌。常用的是磷酸氫二鈉，可溶于水，口服，靜脈注射效果更好。其半衰期14.3min，用藥30~60min后紅細(xì)胞開始下降，可緩解幾個(gè)月至3年。具體用法為74~148MGq/m2體表面積，靜脈注射，總是不超過185MBq，如在3個(gè)月內(nèi)不見效，可再給第二次劑量（37~148）MBq，一般病例不需要第二次用藥。用藥后先有自覺癥狀好轉(zhuǎn)，1個(gè)月左右出現(xiàn)白細(xì)胞和血小板減少，紅細(xì)胞和血紅蛋白常于2~3個(gè)月才下降，脾臟于用藥后1~3個(gè)月開始縮小。32P治療的中位生存期為10~14.5年，PVSG報(bào)道靜脈放血、32P與苯丁酸氮芥治療PV后白血病發(fā)生率分別為7%、16%和20%。大部分病例在用32P后2~8年內(nèi)發(fā)生。（二）化學(xué)治療適用于⑴血小板計(jì)數(shù)高于800~1000×109/L；⑵脾臟顯著腫大，并有脾梗死；⑶嚴(yán)重皮膚瘙癢；⑷老年人及有心肺疾病不宜放血治療；⑸需大量放血才能控制病者。國外曾用苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺與左旋苯丙氨酸氮芥（馬法蘭）等治療，近年來用溴丙哌嗪及羥基脲治療；國內(nèi)用二溴甘露醇和高三尖杉酯堿等治療也有一定效果。⑴羥基脲 是一種骨髓抵制劑，它是通過抑制胸腺嘧啶脫氧核苷酸摻入DNA從而抑制DNA合成。其骨髓抑制時(shí)間短，停藥后數(shù)天后白細(xì)胞就能回升，與放血聯(lián)合治療時(shí)，血栓并發(fā)癥降低。用法：15~20mg/kg.d，或1.0~2.0g，每日2次，但需要每周查血常規(guī)，根據(jù)紅細(xì)胞、血紅蛋白及白細(xì)胞數(shù)增減，用藥后血常規(guī)示紅細(xì)胞、白細(xì)胞下降，脾臟縮小，但需用小劑量（0.5~1.0g/d）維持。目前已文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用羥基脲可明顯減少JAK2V617F突變等位基因的負(fù)荷量，其促白血病作用較其他烷化劑低。⑵白消安 能抑制DNA合成，阻礙細(xì)胞分裂，抑制骨髓造血。2~6mg/d，分次口服，自開始治療1~2個(gè)月，大多數(shù)病例臨床癥狀消失，肝脾縮小，血常規(guī)恢復(fù)正常，全血容量和紅細(xì)胞容量下降，可緩解1年左右。此藥對(duì)白細(xì)胞與血小板增多者，特別是血小板明顯增多者更好。但用藥量過大可引起嚴(yán)重骨髓抑制，長期白細(xì)胞與血小板減少，此外可有皮膚色素沉著等不良反應(yīng)。⑶苯丁酸氮芥 4~6mg/d，分次口服，大部分病例有效，不良反應(yīng)少，僅個(gè)別病例有尋麻疹與禿發(fā)。由于其致白血病的發(fā)生率高，故目前已不用。⑷環(huán)磷酰胺和馬法蘭 屬烷化劑，用藥后中位緩解可達(dá)5~6個(gè)月，因與苯丁酸氮芥一樣有致白血病作用，現(xiàn)已少用。⑸溴丙哌嗪 為哌嗪類藥物，國外已用于治療本病，75mg/d，分3次口服，用藥2~3個(gè)月有90~95%病例可獲完全緩解，以后要維持治療，25mg/d。主要不良反應(yīng)為胃腸道反應(yīng)，但也有使白細(xì)胞和血小板減少等。其誘發(fā)白血病風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高，治療5年、7年和14年的風(fēng)險(xiǎn)分別為6%、9%和27%。⑹高三杉酯堿 屬細(xì)胞非特異性抗腫瘤藥物，抑制腫瘤細(xì)胞的DNA與蛋白質(zhì)合成。一般2~4mg加入500ml液體中每日靜脈滴注，10~14天為1療程。高三杉酯堿治療雖有效但易復(fù)發(fā)，重復(fù)使用仍有效，不良反應(yīng)有心肌損害、胃腸道反應(yīng)、白細(xì)胞和血小板減少等。（三）靶向治療⑴干擾素 1988年R.Silver首先應(yīng)用干擾素來治療PV，能抑制過度增生的紅細(xì)胞和血小板，改善皮膚瘙癢和脾臟腫大癥狀。2008年M.D.Anderson研究小組報(bào)道了聚乙二醇干擾素α2a可使14%JAK2V617F突變陽性的等位基因轉(zhuǎn)陰。用法300萬U~600萬U皮下注射，每周3次。⑵JAK2V617F抑制劑 目前國外正在進(jìn)行JAK2V617F抑制的臨床試驗(yàn)，其中二個(gè)在Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)中明顯有效的藥物有INCB018424和CEP701，INCB018424可使94%的PV患者達(dá)到緩解和部分緩解，對(duì)于羥基脲治療無效的PV患者的療效目前正在臨床試驗(yàn)中。（四）其它治療低劑量的阿斯匹林（50mg/d）可使血栓素A2的產(chǎn)生80%以上，故推薦長期使用，尤其是適用于單獨(dú)靜脈放血治療，以減少血栓栓塞并發(fā)癥。文獻(xiàn)報(bào)道各種抗組胺藥物對(duì)PV相關(guān)的皮膚瘙癢治療有效率為66.6%，西米替丁治療有效率為44%，干擾素治療有效率為80%。PV晚期合并骨髓纖維化（有人稱貸之為PV的衰竭期），患者常有巨脾、貧血、白細(xì)胞、血小板減少，處理十分困難。脾區(qū)放療已證實(shí)無效。脾切除至少可取得暫時(shí)的緩解。由于手術(shù)并發(fā)癥多，死亡率高達(dá)25%，應(yīng)謹(jǐn)慎進(jìn)行，并充分作好術(shù)前準(zhǔn)備。重度貧血者常需定期輸血，也可使用雄激素。缺鐵時(shí)補(bǔ)充鐵劑因可在短期內(nèi)迅速增加紅細(xì)胞而加重病情，故應(yīng)慎重補(bǔ)鐵。PV患者因并發(fā)外科疾病的手術(shù)包括拔牙，術(shù)后并發(fā)癥高達(dá)47%，其中大多數(shù)為出血或血栓并發(fā)癥，故主張術(shù)前先行放血及血細(xì)胞置換，待血象好轉(zhuǎn)后再手術(shù)。九、 病程及預(yù)后本病發(fā)展緩慢，未經(jīng)治療者的中位生存期為1.5年，但經(jīng)各種治療后，中位生存期可達(dá)10~15年。病程長短與許多因素有關(guān)，如治療方法、發(fā)病時(shí)的年齡、及有無并發(fā)癥有關(guān)。不同的治療方法其病程不同，苯丁酸氮芥治療的中位生存期為8.9年，32P治療者為11.8年，靜脈放血治療者為13.9年。發(fā)病年齡中，中年組較老年組病程長。白細(xì)胞與血小板數(shù)高者預(yù)后差。死亡原因以血栓為最多30~40%，其中心肌梗死占50%、腦卒中占31.5%、靜脈血栓占18.5%。其它依次為急性白血?。?9%）、腫瘤（5%）、出血（5%）。余下的病例死于晚期骨髓衰竭（包括骨髓纖維化），其中大多數(shù)因中性粒細(xì)胞缺乏，死于感染，另為血小板減少，死于內(nèi)臟出血。參考文獻(xiàn)[1] James W.Vardimam,Nancy Lee Harris,and Richard D.Brunning. 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（附1例病歷報(bào)告）沈嬋娟 袁朝暉 陳慧娟 胡國瑜* （ 株洲市一醫(yī)院血液科 湖南株洲 412000） 惡性淋巴瘤常由于輸尿管梗阻或腎實(shí)質(zhì)浸潤而導(dǎo)致腎功能衰竭。但是以急性腎功能為首發(fā)表現(xiàn)的淋巴瘤文獻(xiàn)報(bào)道并不多。對(duì)該疾病的治療目前來看并沒有一個(gè)安全成熟的方案。我們最近美羅華聯(lián)合化療成功的搶救了一例以急性腎功能衰竭為首發(fā)表現(xiàn)的B細(xì)胞性淋巴瘤，并結(jié)合文獻(xiàn)復(fù)習(xí)報(bào)道如下：1．病例摘要患者男，64歲。因全身浮腫1周，腹脹5天，尿量減少3天于2008年9月4日入住我院腎內(nèi)科。體查：T36.0℃,P74次/分，R20次/分，BP150/92mmHg，發(fā)育正常，營養(yǎng)中等，全身中度凹陷性浮腫，雙側(cè)耳后分別可捫及大小約2×1cm，1×1cm腫大淋巴結(jié)，質(zhì)韌，無壓痛，與周圍無明顯粘連，雙肺呼吸音清，未聞及羅音，心率74次/分，律齊，無雜音，腹稍膨隆，無壓痛，反跳痛，肝脾肋下未及，移動(dòng)性濁音可疑陽性，雙下肢中度凹陷性浮腫，雙側(cè)巴氏癥（—）。入院時(shí)腎功能示血尿素氮6.4mmol／L，肌酐83μmol／L，尿酸334μmol／L，尿量約500ml/天，肝功能示ALT 11IU/L,AST 20IU/L ,ALB 22.84 g/l，尿常規(guī)示BLD(2+),PRO(3+),24小時(shí)尿蛋白定量0.6/l，血常規(guī)示W(wǎng)BC 17.52*109/l，PT 72*109/l,Hb 92g/l，腎內(nèi)科住院期間監(jiān)測患者腎功能，尿素氮、肌酐進(jìn)行性上升，9月8日腎功能示血尿素氮19.47mmol／L，肌酐449μmol／L，尿酸369μmol／L，無尿，開始行血液透析，隔天1次，9月10日患者出現(xiàn)咽痛，咳嗽，痰中帶血，體查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)扁桃體Ⅱ度腫大，右側(cè)扁桃體窩處可見一腫物，表面破潰，行扁桃體活檢提示B細(xì)胞性非何杰金淋巴瘤，免疫組化如下：CD20(+),CD45RO(+),CD56(-),TIA-1(-),CD79(++),CD3(-)。9月19日腎功能示血尿素氮9.2mmol／L，肌酐760μmol／L，尿酸224μmol／L，考慮患者腎功能進(jìn)行性惡化是淋巴瘤相關(guān)性的，于9月22日轉(zhuǎn)入血液科。轉(zhuǎn)科后完善縱隔、腹部CT檢查未發(fā)現(xiàn)腫大淋巴結(jié)，骨髓檢查示正常骨髓像。于9月23日開始行R－COP（具體用量：美羅華670mg（375mg/m2）d1，環(huán)磷酰胺 0.4 d1，3，5，長春瑞濱 45mg d1，強(qiáng)的松 90mg d1-7）方案化療，化療過程中在環(huán)磷酰胺間歇期輔以血液透析治療，加強(qiáng)營養(yǎng)支持及維持水電解質(zhì)平衡，化療第7天，患者尿量增多為1030ml，復(fù)查腎功能尿素氮，肌酐進(jìn)行性下降。于10月20日復(fù)查腎功能血尿素氮10.95通信作者：胡國瑜，男，博士，血液內(nèi)科副主任醫(yī)師 Email：doctorhgy@163.commmol／L，肌酐222μmol／L，尿酸296μmol／L，尿量已恢復(fù)正常，予以第二程化療，方案R－CHOP（具體用量：美羅華670mg d1，CTX 0.4 d2，4，6，NVB 45mg d1，強(qiáng)的松 60mg d1-7，表阿霉素 120 mg d2 ），化療過程順利，于11月4日出院?；颊叽舜纬鲈汉螅话闱闆r可，按期返院行化療，予以2程R－CHOP及2程CHOP，腎功能完全正常，獲得完全緩解。2．討論：2．1 惡性淋巴瘤引起急性腎功能衰竭的機(jī)制淋巴細(xì)胞增值性疾病中腎臟受累是很常見的，最常見的原因就是腹膜后腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)壓迫雙側(cè)輸尿管，此外就是NHL浸潤腎實(shí)質(zhì)引起腎功能不全。盡管尸檢顯示42％－57%的NHL患者有腎臟受累，但臨床腎臟疾病的報(bào)道率只有0.5%－7.3%。 [1]。關(guān)于淋巴瘤相關(guān)性急性腎功能衰竭的機(jī)制有如下一些報(bào)道：自發(fā)性腫瘤溶解綜合癥引起的嚴(yán)重的高尿酸血癥從而導(dǎo)致腎功能衰竭[2]，淋巴瘤在發(fā)展過程中浸潤腎臟，或者原發(fā)于腎實(shí)質(zhì)的淋巴瘤引起腎功能惡化[3]，高鈣血癥引起的腎鈣沉著癥導(dǎo)致的腎功能衰竭[4]，淋巴瘤相關(guān)性嗜血細(xì)胞綜合癥的高細(xì)胞因子血癥引起腎小管壞死樣病變從而導(dǎo)致腎功能衰竭，此外血管內(nèi)淋巴瘤引起急性腎前性腎衰[5]。該患者我們行了腹部CT檢查未發(fā)現(xiàn)腹腔腫大淋巴結(jié)，排除了排除了腹腔腫大淋巴結(jié)壓迫雙側(cè)輸尿管造成的梗阻性腎病，該患者血尿酸正常排除了尿酸性腎病，此外該患者無出血，失水表現(xiàn)不考慮血容量不足引起的急性腎前性腎衰，患者骨髓細(xì)胞學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)嗜血組織細(xì)胞，不支持嗜血細(xì)胞綜合癥相關(guān)的腎損害，患者腎功能惡化，考慮淋巴瘤浸潤腎實(shí)質(zhì)可能性大，但需行腎臟活檢以進(jìn)一步明確。2．2 美羅華在以急性腎功能衰竭為首發(fā)表現(xiàn)的B細(xì)胞性惡性淋巴瘤的治療對(duì)伴急性腎功能衰竭的淋巴瘤病人并無標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，因?yàn)閳?bào)道的病例比較少。最常見的治療方案是環(huán)磷酰胺，長春新堿，阿霉素，潑尼淞（CHOP）[6,7] ，各種其他的化療藥物也有所嘗試[7,8]。2000年美羅華獲得中國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于我國臨床，用于難治復(fù)發(fā)的CD20陽性的B細(xì)胞性非何杰金淋巴瘤，但美羅華在急性腎功能衰竭的病人中經(jīng)驗(yàn)尚有限。美羅華是一種嵌合鼠/人的單克隆抗體，該抗體與正?；驉盒訠細(xì)胞淋巴瘤表面的CD20特異性的結(jié)合，并引發(fā)B細(xì)胞溶解的免疫反應(yīng)。細(xì)胞溶解的可能機(jī)制包括補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。此外，體外實(shí)驗(yàn)證明，利妥昔單抗可使藥物抵抗性的人體淋巴細(xì)胞對(duì)一些化療藥的細(xì)胞毒性敏感。放射性核素造影顯示大約7％－28％的利妥西單抗單抗通過尿路排泄，大部分的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)集中在研究美羅華血漿濃度和臨床療效之間的關(guān)系，腎臟在藥物清除方面的作用尚不是很清楚[10]。Anand P. Jillella,等的研究顯示血液透析后美羅華的血漿濃度較透析前高，且在透析液標(biāo)本中沒有發(fā)現(xiàn)美羅華，證實(shí)美羅華不被血液透析所清除[11]。美羅華在急性腎功能衰竭的病人的應(yīng)用，經(jīng)驗(yàn)是有限的，通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，我們找到了其他5例應(yīng)用美羅華的并有急性腎功能衰竭的淋巴瘤病人[3,12,13,14] ，其中4例病人行了血液透析[3,12, 14],其中1例病人美羅華是375mg/m2，分次給藥，100mg/天[12]，其余的都是一次足量375mg/m2，這5位病人都未出現(xiàn)美羅華輸注相關(guān)副作用，其中3例病人獲得完全緩解，腎功能恢復(fù)[3,12,13]，1例病人部分緩解，4個(gè)月后死于敗血癥[12]，還有1例疾病沒有進(jìn)展，腎功能沒有惡化[14]。我們這個(gè)病人，化療前一周3次血透，但腎功能進(jìn)行惡化，少尿甚至無尿，淋巴瘤診斷明確后，與R－COP方案化療一程，化療期間行3次血液透析，化療第7天患者尿量增多，腎功能好轉(zhuǎn)，已無需再行血液透析治療，此后該病人行了3程R－CHOP及2程CHOP方案。在第2程化療結(jié)束后患者臨床癥狀緩解，腎功能基本恢復(fù)正常。隨訪該病人至今，患者一般情況好，完全緩解。綜合以上病例，美羅華在急性腎衰病人中的應(yīng)用是安全的。參考文獻(xiàn)：1. Geffen DB, Fisher RI, Longo DL, et al. Renal involvement in diffuse aggressive lymphomas:results of treatment with combination chemotherapy[J]. Journal of Clinical Oncology, 1985 May;3(5):646-532. Karagiannis A, Tsorlalis I, Kakafika A, et al. Acute renal failure due to tumor lysis syndrome in a patient with non-Hodgkin's lymphoma[R]. 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胡國瑜1 張玲2 袁朝暉2 羅丹2（1. 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院血液科博士研究生，現(xiàn)在株洲市一醫(yī)院血液工作，2.株洲市一醫(yī)院血液科,412000）[摘要] [目的] 探索JAK2V617F突變?cè)谠谡嫘约t細(xì)胞增多癥的診斷與鑒別臨床應(yīng)用價(jià)值，并篩選一種適合于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展的檢測JAK2V617F突變的實(shí)驗(yàn)方法。[方法] 對(duì)38例確診為真性紅細(xì)胞增多癥患者、20例繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥的患者和20例正常健康對(duì)照者的外周血中性粒細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行提取，并應(yīng)用等位基因PCR技術(shù)和PCR產(chǎn)物直接序列測定對(duì)JAK2基因第14號(hào)外顯子第1849位核苷酸是否存在G→T突變，以確定JAK2V617F突變對(duì)診斷真性紅細(xì)胞增多癥的特異性，同時(shí)比較二種檢測方法的敏感性和特異性。[結(jié)果] 應(yīng)用PCR產(chǎn)物序列測定的方法在38例真性紅細(xì)胞增多癥有32例（占84%），在20例繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥和20例正常健康對(duì)照組中均發(fā)現(xiàn)一例突變，而用等位基因特異性PCR技術(shù)在在38例真性紅細(xì)胞增多癥檢測到35例（占92%）存在JAK2V617F突變，并經(jīng)過PCR產(chǎn)物正反序列測定得到證實(shí)，在20例繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥和20例正常健康對(duì)照組中均發(fā)現(xiàn)一例突變。[結(jié)論] JAK2V617F突變的檢測可作為診斷為真性紅細(xì)胞增多癥的特異性分子標(biāo)志物，而等位基因特異性PCR技術(shù)在檢測JAK2V617F突變中較PCR產(chǎn)物序列測定具有更高的敏感性和特異性，更適合于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展。[關(guān)鍵詞] 真性紅細(xì)胞增多癥，慢性骨髓增殖性疾病，JAK2V617F突變The clinic study of JAK2V617F mutation detection in diagnosis of polycythemia veraHu Guo-yu1,Zhang Ning2,Yuang Chao-hui2,Luo Dan2(1. Department of Hematology,The Second Xiaya hospital,2. Department of Hematology ,The First hospital of ZhuZhou city)[Object] To investigate the diagnostic value of JAK2V617F mutation in diagnosis and differential diagnosis of polycythemia vera,and screen a more simple method for clinic laboratory to detecte the mutation of JAK2V617F.[Method] DNA was extracted by standard procedures after isolating total leukocytes from peripheral blood mononuclear cells by density gradient centrifugation over Histopaque 1077.DNA samples were amplified. Single-stranded biotinylated PCR products were prepared for sequencing . At the same time ,in order to testify the realiability of the allele-specific PCR,we also applied the allele-specific PCR using two forward primer and one common reverse primers for identifying the mutation.[Result] In 32of 38 patients with polycythemia vera, JAK2V617F mutation was determined by conventional DNA sequencing------.But the allele-specific PCR detected 35 patients occurs JAK2V617F mutation.And these were testified by DNA sequencing.None mutation was found in secondary polycythemia and normal control.[ Conclusion]: A-gain -of-function mutation of JAK2V617F occurs in nearly all patients with PV,and JAK2V617F mutation should be a molecular marker in diagnosis of polycythemia vera..Allele-specific PCR is a very sensitive and specific method for detecting JAK2V617F mutation.早在1892年Vaquz就報(bào)道了一例以持續(xù)性血細(xì)胞增多并伴有發(fā)紺的病例, 但直到1974年P(guān)rchal在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)[1]：真性紅細(xì)胞增多癥（PV）患者骨髓的紅系祖細(xì)胞在體外能在缺乏促紅細(xì)胞生成素﹙EPO﹚的條件下生長,這與隨后的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)均證明PV是一種造干血細(xì)胞克隆性疾病[2]。對(duì)診斷PV盡管有嚴(yán)格的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，但是由于對(duì)其分子發(fā)病機(jī)制不了解，因此對(duì)紅細(xì)胞增多癥的診斷與鑒別診斷缺乏像bcr/abl在診斷慢性粒細(xì)胞白血病一樣的特異性分子標(biāo)志物。在2005年，國際上4個(gè)不同的研究組[4-7]幾乎在同一時(shí)期在不同的國際著名醫(yī)學(xué)期刊報(bào)道了在絕大數(shù)真性紅細(xì)胞增多癥﹙PV﹚患者存在著JAK2基因14號(hào)外顯子1894位核苷酸G→T的突變（JAK2V617F突變），這為PV的診斷提供了一個(gè)特異性分子標(biāo)志物，為觀察JAK2V617F突變的檢測在診斷PV的臨床應(yīng)用價(jià)值，并為臨床實(shí)驗(yàn)室篩選出一種更加簡便可靠的JAK2V617F突變的檢測方法，我們應(yīng)用等位基因PCR技術(shù)和PCR產(chǎn)物直接序列測定對(duì)38例確診為真性紅細(xì)胞增多癥患者、20例繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥的患者和20例正常健康對(duì)照組的外周血中性粒細(xì)胞JAK2V617F突變進(jìn)行了檢測，現(xiàn)報(bào)道如下：1 資料與方法一般資料 38例真性紅細(xì)胞增多癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)均按WHO擬定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，平均年齡61歲，其中男性18例，女性20例； 20例繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥其中男性13例平均年齡64歲，其中男性13例，女性7例；20例正常健康對(duì)照者平均年齡30歲，其中男性6例，女性14例。方法標(biāo)本采集 所有患者及正常對(duì)照組均常規(guī)采外周靜脈肝素抗凝血10ml，并用中性粒細(xì)胞分離液分離出中性粒細(xì)胞，用酚氯抽提法提取外周血中性粒細(xì)胞基因組DNA，用TE保存在在-20℃冰箱中備用。1.2.2測序PCR PCR直接序列測定的前向引物為5′-TCCTCAGAACG TTGA TGGC AG-3′，反向引物為5′-ATTGCTTTCCTTTTTCACAAGAT-3′，測序PCR的反應(yīng)體系組成：80ng基因組DNA、MgCl2 1.25mM、dNTP 0.2mM、Taq酶2U、前向引物和反向引物的濃度均為15Pmol，總體積50ul。將上述成份依次加入到PCR反應(yīng)管中，輕輕混勻后短暫離心，離心速度為3000rpm/min，離心30sec,然后置于自動(dòng)PCR儀內(nèi)擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94℃，7min；然后進(jìn)入熱循環(huán)，條件為94℃變性，30 Sec； 56℃退火30Sec,72℃延伸1 min,為充分讓基因組DNA被擴(kuò)增，在第一個(gè)循環(huán)時(shí)，72℃延伸7min ,共36個(gè)循環(huán),循環(huán)結(jié)束后取5ulPCR產(chǎn)物作1.5%瓊脂糖凝膠電泳，如在453bp處有明顯的產(chǎn)物條帶將PCR產(chǎn)物送測公司行PCR產(chǎn)物序列測定。1.2.3等位基因特異性PCR用一個(gè)共同的下游引物，二個(gè)上游引物，其中一個(gè)引物包含有突變位點(diǎn)（只擴(kuò)增有突變的基因序列，即在3端的第三個(gè)核苷酸含有一個(gè)故意錯(cuò)配的堿基）以提高特異性（擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為203bps）,另一個(gè)上游引物可從突變型及野生型等位基因中擴(kuò)增，其產(chǎn)物大小為364bps，作為PCR內(nèi)參照，其具體序列如下：內(nèi)參照前向引物：5-ATCTATAGTCATGCTGAAA GTA GGA GA AAG-3，特異性前向引物：5-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3，共同的反向引物：5-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3，其反應(yīng)體系組成同測序PCR，引物濃度為兩個(gè)前向引物均為7.5Pmol，共同的反向引物為15Pmol。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃，7min；然后進(jìn)入熱循環(huán)，條件為94℃變性，30 Sec；58℃退火30Sec,72℃延伸1 min,為充分讓基因組DNA被擴(kuò)增，在第一個(gè)循環(huán)時(shí)，72℃延伸保持7min ,共36個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5ul行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，如在364bps和203bps處均有明顯的產(chǎn)物帶者為JAK2V617F突變陽性，如只在364bps處有一個(gè)單一產(chǎn)物帶者為JAKV617F突變陰性。1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并在2 結(jié)果我們應(yīng)用PCR產(chǎn)物序列分析，對(duì)38例真性紅細(xì)胞增多癥患者、20例繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥患者及20例正常對(duì)照者的JAK2基因進(jìn)行體PCR擴(kuò)增，并對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行堿基序列測定，一次性PCR產(chǎn)物序列測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)38例真性紅細(xì)胞增多癥有32例存在JAK2V617F突變，突變率為84%,而在20例繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥和20例正常對(duì)照者中未發(fā)現(xiàn)一例存在JAK2V617F突變。同時(shí)我們應(yīng)用等位基因特異性PCR技術(shù)，對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行了JAK2V617F突變的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，38例真性紅細(xì)胞增多癥患者共檢測出35例（占92%）患者存在JAK2V617F突變（，而對(duì)于20例繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥和20例正常對(duì)照者的檢測中均未發(fā)現(xiàn)一例突變，這說明JAK2V617F突變?cè)谡嫘约t細(xì)胞增多癥的診斷中具有高度的特異性。為了確定等位基因特異性PCR技術(shù)在檢測JAK2V617F突變的可靠性，我們對(duì)常規(guī)一次性PCR產(chǎn)物序列測定未檢測出有JAK2V617F突變而等位基因特異性PCR技術(shù)檢測存在JAK2V617F突變的三例真性紅細(xì)胞增多癥患者的JAK2第14號(hào)外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行反復(fù)的5/→3/和3/→5/序列測定，結(jié)果證實(shí)這三例患者確實(shí)存在JAK2V617F突變，這說明等位基因特異性PCR技術(shù)在檢測JAK2V617F突變中具有較高的特異性和敏感性。泳道1、4、5、7、10為真性紅細(xì)胞增多癥，泳道2、3、6為繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥，泳道8、9為正常對(duì)照，在364bps和203bps處均有明顯的產(chǎn)物帶者為JAK2V617F突變陽性，如只在364bps處有一個(gè)單一產(chǎn)物帶者為JAKV617F突變陰性3、討論早在1892年Vaquz就報(bào)道了一例以持續(xù)性血細(xì)胞增多并伴有發(fā)紺的病例，但有關(guān)該病的分子發(fā)病機(jī)制不明確，因而導(dǎo)致對(duì)該疾病的診斷缺乏像bcr/abl對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病的診斷一樣的分子標(biāo)志物。1974年，Prchal JF[1]發(fā)現(xiàn)PV患者的紅系祖細(xì)胞在體外培養(yǎng)能自發(fā)性形成集落，隨后，研究者們又發(fā)現(xiàn)這些患者的紅系祖細(xì)胞和髓系祖細(xì)胞對(duì)幾種不同的生長因子特別敏感[8-9],這些實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，PV發(fā)病的始動(dòng)因子可能存在于多種生長因子受體下游的信號(hào)途徑之中。JAK2是一種非受體酪氨酸激酶，在多種造血生長因子受體信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵性作用，因此，JAK2基因是研究CMPDs分子發(fā)病機(jī)制特別受關(guān)注的基因[10-11]。大量的研究資料證實(shí)，JAK2是一種非受體胞漿酪氨酸激酶，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)來自各種細(xì)胞因子和生長因子受體的信號(hào)，包括白介素-3（IL-3）、白介素-5(IL-5)、促紅細(xì)胞生成素（EPO）、粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）和促血小板生成素（TPO），在髓系發(fā)育中起重要作用。因此，JAK2基因是研究CMPD發(fā)病分子機(jī)理的理想靶基因。我們運(yùn)用PCR產(chǎn)物序列測定對(duì)38例PV患JAK2第14號(hào)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DNA測序結(jié)果顯示，32例PV患者中（84%）存在JAK2V617F的突變，而在20例繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥及正常對(duì)照者中未發(fā)現(xiàn)一例突變，且我們檢測的結(jié)果與國外其它幾個(gè)研究小組的結(jié)果相一致[4-7]，這說明JAK2V617F突變是PV患者的分子發(fā)病機(jī)制。對(duì)于任何一種惡性疾病中多數(shù)細(xì)胞中存在突變的解釋目前只有二種：突變可能導(dǎo)致異?？寺〉纳L及生存優(yōu)勢(shì)；或者可能表明在同一細(xì)胞存在偶發(fā)的“一過性”突變。后一種解釋不可能作為JAK2V617F突變的解釋理由，因?yàn)榻^大多數(shù)PV患者存在同樣的突變。JAK2V617F突變之所以是PV的發(fā)病機(jī)制之一，因?yàn)檫@種突變發(fā)生在假激酶（JH2）區(qū)域的高度保守區(qū)，該區(qū)域與真正的酪氨酸激酶區(qū)域是同源的，但缺乏關(guān)鍵的催化基團(tuán)。JAK2的結(jié)構(gòu)模型提示V617至E621殘基形成一個(gè)環(huán)，連結(jié)假激酶區(qū)域N端突起的兩條β鏈，C618接觸活化環(huán)。V617、C618和其它一些局部殘基可抑制激酶活化環(huán)從非活化構(gòu)象向活化構(gòu)象移動(dòng)（即，V617 區(qū)域在負(fù)性調(diào)節(jié)JAK2信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)發(fā)揮直接作用）[12]。大型的芳香氨基酸苯丙氨酸替代纈氨酸，很可能破壞這種負(fù)性調(diào)節(jié)，這也可以從分子基礎(chǔ)上解釋為什么PV患者的紅系祖細(xì)胞在體外培養(yǎng)能自發(fā)性形成自發(fā)集落[1]，且對(duì)幾種不同的生長因子特別敏感[8、13-14],但是對(duì)于JAK2V617F突變陰性患者的發(fā)病分子基礎(chǔ)則有待于進(jìn)一步研究。文獻(xiàn)報(bào)道，一次性PCR產(chǎn)物的核苷酸序列分析并不能檢測到所有的V617F突變，即PCR產(chǎn)物測序可有假陰性結(jié)果。有報(bào)道只有在超過40%的細(xì)胞存在雜合子突變時(shí)方可通過基因測序重復(fù)檢測到突變，而應(yīng)用敏感的等位基因特異性PCR測定技術(shù)，當(dāng)3%的細(xì)胞存在雜合子突變時(shí)即可檢測到[15]。我們的結(jié)果顯示，應(yīng)用敏感的特異性等位基因PCR方法的確能夠提高JAK2V617F突變的陽性檢測率，為證實(shí)這一現(xiàn)象，我們通過反復(fù)PCR產(chǎn)物正么序列測定證實(shí)了該方法對(duì)突變檢測的可靠性。有關(guān)CMPDs的診斷通常是復(fù)雜的，如果要作PRV-1或中性粒細(xì)胞的抗原NBI/CD177的表達(dá)則更加復(fù)雜，且費(fèi)用昂貴。由于JAK2V617F突變僅發(fā)現(xiàn)在PV患者中，而存在于繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥及正常對(duì)照中，因此檢測JAK2V617F突變對(duì)診斷PV有重要的臨床意義。我們的實(shí)驗(yàn)證明用等位基因特異性PCR方法來檢測JAK2V617F突變是一種簡單、費(fèi)用低、特異性高的方法，可提高對(duì)PV 患者JAK2V617F突變的陽性檢出率，可以作為臨床PV分子診斷的常規(guī)檢查手段。參考文獻(xiàn)[1] Prchal JF,Axelrad AA. 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