心血管內(nèi)科

文獻(xiàn)綜述 卡托普利干預(yù)細(xì)胞凋亡作用研究進(jìn)展 卡托普利是第一個(gè)口服有效的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，自從1981年由美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療高血壓以來(lái)，卡托普利在治療充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重構(gòu)和糖尿病腎病中取得了良好的療效。它在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中應(yīng)用范圍最廣[1]。隨著相關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)的迅猛發(fā)展和對(duì)卡托普利藥理作用研究的深入，近來(lái)人們?cè)诖罅康膭?dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)卡托普利具有抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重作用[2-7]，本文采用文獻(xiàn)回顧的方法對(duì)卡托普利干預(yù)細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)機(jī)制作一綜述。1卡托普利的藥理作用卡托普利是含有巰基（SH）的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑,它不但具有其他的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑藥理作用：（1）阻止血管緊張素II(AngII)的生成和作用；（2）保存緩激肽的活性；（3）保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞與抗動(dòng)脈粥洋硬化作用；（4）抗心肌缺血和心肌保護(hù)作用；（5）增加糖尿病病人對(duì)胰島素的敏感性；（6）阻止心血管病理性重構(gòu)，而且能通過(guò)所含有的巰基清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，起到穩(wěn)定線粒體膜的作用[8]，此外卡托普利還具有抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子，白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子的免疫學(xué)效應(yīng)[9]。2: 細(xì)胞凋亡2.1 細(xì)胞凋亡的概念及其基因調(diào)控細(xì)胞凋亡是指在一定的生理和病理?xiàng)l件下,遵循自身的程序通過(guò)啟動(dòng)內(nèi)部機(jī)制,主要是內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活,從而結(jié)束其生命的過(guò)程.目前的研究表明，細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的一種細(xì)胞死亡的特殊形式，其調(diào)控基因可分為促凋亡基因，包括野生型P53.c-myc，c-fas，c-jun，bcl-bax，ras，IC等基因；抑凋亡基因主要包括Bcl-2和突變型P53。自1972年Kerr[10]等首次提出細(xì)胞凋亡概念以來(lái), 細(xì)胞凋亡一直是近年來(lái)醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn).2.2細(xì)胞凋亡的通路細(xì)胞凋亡的通路主要有兩條,一條是死亡受體途徑[11]：死亡受體屬于腫瘤因子受體(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞內(nèi)部分含有一個(gè)死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配體是一個(gè)同源三聚體，每個(gè)三聚體分子結(jié)合3個(gè)Fas分子。一旦與三聚體的配體相結(jié)合，F(xiàn)as通過(guò)胞內(nèi)段的DD和FADD羧基端的DD之間的相互作用，募集胞質(zhì)中的銜接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas區(qū)域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增強(qiáng)，而自我剪切活化 ?；罨腃aspase-8釋放到細(xì)胞質(zhì)中即激活Caspase—3，引起細(xì)胞凋亡；另一條是線粒體途徑[12]：線粒體通路[2]：各種促凋亡信號(hào)如DNA損傷、生長(zhǎng)因子去除等誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，在ATP/dATP存在的情況下，細(xì)胞色素C結(jié)合到Apaf-1的WD40重復(fù)區(qū)域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-細(xì)胞上色素C多聚復(fù)合體。此復(fù)合體通過(guò)Apaf-1的氨基端的CARD與Caspase-9原域的CARD之間的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞質(zhì)的Caspase—9。Caspase—9酶原之間因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作為起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3促使細(xì)胞凋亡。3卡托普利抑制細(xì)胞凋亡3.1卡托普利抑制AngII誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡AngII對(duì)細(xì)胞凋亡有重要的影響，但作用機(jī)制較復(fù)雜，不同的細(xì)胞表現(xiàn)出不同的作用：既可以引起細(xì)胞凋亡，也可以引起細(xì)胞增生[13]，這主要與AngII和其相應(yīng)的受體AT1，AT2結(jié)合所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。Goldenberg I[14]等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AngII與其相應(yīng)的受體AT1，AT2結(jié)合并共同作用，在增加AT1，AT2受體蛋白的表達(dá)的同時(shí)并明顯上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，進(jìn)而激活caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但亦有研究表明：AT1受體和AT2受體與AngII結(jié)合而發(fā)揮的作用相反：即AT1受體與AngII結(jié)合具有促進(jìn)細(xì)胞增生的作用；AT2受體與AngII結(jié)合具有誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[15]。這與Liangxuguo[16]等應(yīng)用卡托普利和氯沙坦干預(yù)由AngII所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)內(nèi)結(jié)果相一致：氯沙坦作為AT1受體拮抗劑，雖然阻斷了AngII與AT1的結(jié)合,但對(duì)AngII所誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡無(wú)影響，從而說(shuō)明AT1受體在AngII所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中無(wú)明顯作用；而使用卡托普利能部分抑制AngII誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其可能機(jī)制為卡托普利通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，阻止了AngI轉(zhuǎn)換為AngII，從而不但使AngII所產(chǎn)生的氧自由基和炎性介質(zhì)減少，而且部分阻斷AngII與其相應(yīng)受體結(jié)合所至的細(xì)胞凋亡作用。同時(shí)，還能降低促凋亡基因表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從分子水平發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用[17]。此外還與卡托普利能減少緩激肽的降解，增加NO的分泌有關(guān)[18]。3.2卡托普利抑制氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡氧自由基可以通過(guò)直接損傷DNA，攻擊含有酶活性的蛋白質(zhì)，影響核基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這已經(jīng)在大量的實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)。同時(shí)，亦有實(shí)驗(yàn)證明用抗氧化劑或氧自由基清除劑干預(yù)氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，能通過(guò)阻止P53的激活。下調(diào).BAX的表達(dá)和降低Caspase-3的活性而抑制細(xì)胞凋亡[19]。而卡托普利本身含有巰基（SH），不但具有抑制微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及白細(xì)胞產(chǎn)生氧自自由基的作用，而且本身是強(qiáng)有力的氧自由基清除劑 [20]。Tambd[21]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利對(duì)缺血再灌注過(guò)程中產(chǎn)生氧自由基所至的細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，這與我國(guó)學(xué)者胡青松等[22-23]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利具有抑制羥自由基誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌凋亡的結(jié)論相一致。由此可見(jiàn)，卡托普利通過(guò)抑制和清除氧自由基的雙重作用來(lái)阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇而激發(fā)PT孔開(kāi)放，同時(shí)，卡托普利所含有巰基（SH）可使PT孔處于關(guān)閉狀態(tài)[24]，穩(wěn)定了線粒體膜電位，阻止Cyt-C及凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）從線粒體中釋放，阻斷細(xì)胞凋亡的線粒體途徑，從而抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí)卡托普利對(duì)線粒體復(fù)合體II-III質(zhì)子泵出速度和電子傳遞速度升高有調(diào)節(jié)作用，使質(zhì)子偶聯(lián)更緊密，從而保護(hù)線粒體的呼吸功能，改善細(xì)胞的能量代謝[25]，有效阻止氧自由基所造成的細(xì)胞內(nèi)鈣超載。3.3卡托普利阻止緩激肽降解而抑制細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證明卡托普利能通過(guò)減少緩激肽的降解，使增加的緩激肽通過(guò)與其β2受體結(jié)合,進(jìn)而激活磷酸酯酶C(PLC),產(chǎn)生的IP3使細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放而一氧化氮合酶（NOS）和上調(diào)ecNOS，從而增加一氧化氮（NO）的產(chǎn)生[26]。NO對(duì)細(xì)胞具有雙重作用，即在通過(guò)產(chǎn)生氧自由基介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，可以通過(guò)抑制Caspase酶活性而產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡作用，作用結(jié)果與細(xì)胞類型和NO的量有關(guān)[27]。Dimmelers[18]等實(shí)驗(yàn)證明NO能通過(guò)抑制Caspase酶活性而阻斷AngII所致的細(xì)胞凋亡作用，但Fukuok [28]等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NO能通過(guò)上調(diào)Fas及Bax的表達(dá)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此我們可以認(rèn)為卡托普利可能一方面通過(guò)適當(dāng)增加NO水平，另一方面通過(guò)其所含有巰基（SH）而清除過(guò)量的NO產(chǎn)生的氧自由基而共同發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。此外，通過(guò)緩激肽-NO 途徑可以激活蛋白激酶C，降低細(xì)胞代謝水平，降低ATP及氧的需求，改善細(xì)胞的能量代謝，阻止細(xì)胞凋亡[29]。3.4 其他最近研究發(fā)現(xiàn)卡托普利能阻斷由Fas受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡：UhalBD[4]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利通過(guò)降低肺泡上皮細(xì)胞表面的Fas和其配體（Fasl）的表達(dá)而抑制凋亡。此外Odakac Mizuochi T[30]等證實(shí)卡托普利通過(guò)干擾外周T細(xì)胞表面的Fas和Fasl之間的相互作用，并能降低凋亡過(guò)程中產(chǎn)生的Caspase-3類似物的活性而抑制凋亡。這為我們研究卡托普利在自身免疫病的應(yīng)用開(kāi)辟了新的道路。4卡托普利誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已有實(shí)驗(yàn)證明卡托普利具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Buemi M[5]等發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)中卡托普利0.23mg可以引起血管平滑肌細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，同樣Anne Mette[6]等動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)卡托普利通過(guò)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡而抑制受損傷后血管內(nèi)膜的增生狹窄。這其中的具體機(jī)制還不清楚，可能是卡托普利能降低心肌梗死后血管內(nèi)膜AngII的AT1受體的mRNA的表達(dá)[31]，從而引起AngII與AT1結(jié)和所致的細(xì)胞增生及抗凋亡作用減弱，而與AT2 受體結(jié)合所致的細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)的結(jié)果[32-33]。此外Ohwada T[34]等研究發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠血管拉傷后給予血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療，不但可以明顯增加新生內(nèi)膜ecNOS的表達(dá),同時(shí)也可上調(diào)iNOS的表達(dá)，導(dǎo)致NO產(chǎn)生過(guò)多，而過(guò)多NO能通過(guò)上調(diào)Fas及Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡[28]。近來(lái)Glzzerman I[7]等在臨床上應(yīng)用ACEI治療腎移植術(shù)后病人發(fā)生的紅細(xì)胞增多癥取得了成功，并闡明其作用機(jī)制為ACEI能誘導(dǎo)腎移植術(shù)后病人Fas及其接頭蛋白FADD的mRNA表達(dá)增加,上調(diào)其蛋白表達(dá)，但對(duì)BCL-2.Bcl-xl.Bax,caspase-8.caspase-3的表達(dá)無(wú)影響，從而通過(guò)激活死亡受體途徑誘導(dǎo)祖紅細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，卡托普利對(duì)細(xì)胞凋亡所具有促進(jìn)的作用無(wú)疑有利于治療冠狀動(dòng)脈手術(shù)后的內(nèi)膜增生和再狹窄，同時(shí)也為其治療IgA腎病及糖尿病腎病提供了新的理論基礎(chǔ)。問(wèn)題和展望綜上所述，卡托普利具有抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重作用。但目前的問(wèn)題是卡托普利為什么會(huì)產(chǎn)生兩種截然不同的藥理作用。我們推測(cè)這主要取決于細(xì)胞類型，卡托普利的劑量以及機(jī)體所處病理狀態(tài)等因素，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。總之，卡托普利干預(yù)細(xì)胞凋亡的作用已經(jīng)得到了共識(shí)：卡托普利通過(guò)阻斷AngII與其受體之間的作用，減少氧自由基的產(chǎn)生，調(diào)控NO的合成，干擾Fas和Fasl之間的相互作用來(lái)激活或阻斷細(xì)胞凋亡程序，從而抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們有理由相信：通過(guò)對(duì)卡托普利抗細(xì)胞凋亡作用深入研究，無(wú)疑為探討充血性心力衰竭，缺血再灌注損傷以及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及手術(shù)后的再狹窄等帶來(lái)突破，并可推動(dòng)心血管疾病診斷及治療的發(fā)展。參考文獻(xiàn)1 蘇定馮 心血管藥理學(xué)(M) 第一版 北京 科學(xué)技術(shù)出版社 2001,241-2492 LihlSuzukj J, Bayna E，Zhang FM et，al。Lipopolysaccharide induces apoptosis in adult rat ventricular myocytes via 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Effect of losartan and captopril on expression of cardioc angiotensinII AT1 receptor mRNA in rats following myocardial in farction Zhongguo Yao Li Xue Bao.1997 sep;18(5):431-41232 Yamada T ,Akishita M,Pollman MJ et al .AngiotensinII type 2 receptor mediates vascular smooth muscle cell apoptosis and angiotensinII type 1 receptor action: an in vitro gene transfer study life .Sci 1998:63 :289-29533.Tea BS,Der PB, Sarkissian S et al Proapoptotic and growth-inhibitory role of angiotensinII type 2 receptor in vasucar smooth muscles cell of spontaneously hypertension rats in vivo Hypertension 2000,May,35(5):1069-73 34 Ohwada T, Ishibshi T ,Yaoita H et al .Different contribution of apoptosis to the antiproliferative effects of L-arginine.enalapril and losartan on neointimal growth inhibition after balloon arterial injury Circ J2002 Oct :66(10):965-71立題依據(jù)缺血再灌注損傷不但是心血管疾病中一種常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，而且也是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度凋亡的主要原因之一；而細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的特征之一，細(xì)胞凋亡的多少?zèng)Q定了缺血再灌注損傷的輕重。故研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞在缺血再灌注損傷時(shí)凋亡的發(fā)生機(jī)制和利用藥物來(lái)抑制VEC在缺血再灌注損傷所致的凋亡成為心血管研究領(lǐng)域中的重點(diǎn)課題。 缺血預(yù)處理（ischemic preconditionging，IPC）是體內(nèi)最強(qiáng)大的保護(hù)機(jī)制，是一種多元性細(xì)胞防御現(xiàn)象[1]：即預(yù)先反復(fù)短暫缺血可延緩或減輕組織后續(xù)缺血再灌注損傷的現(xiàn)象。而IPC的保護(hù)作用之一便是通過(guò)抑制缺血再灌注損傷后缺血區(qū)存活的心肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生可逆或不可逆壞死或凋亡來(lái)體現(xiàn)的[2]。誘導(dǎo)預(yù)處理的因素從早期的缺血、缺氧、快速起搏和熱應(yīng)激到現(xiàn)在的藥物預(yù)處理。但由于缺血本身是一種損傷，實(shí)施損傷性預(yù)處理由于倫理觀念臨床上還難以接受，故誘導(dǎo)預(yù)處理的研究已從缺血、生物、物理、化學(xué)源性擴(kuò)展到藥物性預(yù)處理（pharmacologic preconditioning）即通過(guò)藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)呈現(xiàn)的心臟保護(hù)作用。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）具有藥物預(yù)處理作用。目前研究表明， IPC對(duì)心臟的保護(hù)作用具有雙時(shí)相性，即：心臟保護(hù)作用在2-3個(gè)小時(shí)后消失的早期或經(jīng)典預(yù)處理；和反復(fù)短暫缺血后20-24小時(shí)緩慢出現(xiàn)的晚期預(yù)處理或延遲性保護(hù)作用或第二保護(hù)窗口。預(yù)處理的早期保護(hù)作用時(shí)間窗較窄，必須在缺血再灌注損傷前給予，故臨床可操作性不強(qiáng)，相反，晚期預(yù)處理作用時(shí)間跨度大，在臨床運(yùn)用時(shí)更有可行性和便利性，因此，更具實(shí)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)意義。而且ACEI通過(guò)誘導(dǎo)或增強(qiáng)預(yù)處理早期心臟保護(hù)作用已有較多研究，而誘導(dǎo)預(yù)處理的延遲保護(hù)作用的報(bào)道不多，而且大多數(shù)ACEI為前體藥，需要在體內(nèi)代謝后才具有生物活性。而卡托普利是非前體藥，具有生物活性，因此在我們的研究中，采用了卡托普利。IPC保護(hù)作用不僅存在于器官水平，而且存在于細(xì)胞水平；已有研究證明藥物預(yù)處理是通過(guò)藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)源性物（腺苷，緩激肽，降鈣素基因相關(guān)肽，前列環(huán)素（PGI2），一氧化氮（NO）等），而呈現(xiàn)的保護(hù)心肌和血管的作用。其研究方法也是通過(guò)模擬IPC而建立起來(lái)的，而我們采用模擬IPC而建立起來(lái)的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明卡托普利對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行晚期預(yù)處理后進(jìn)行缺氧復(fù)氧損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象明顯減輕，從而證明卡托普利對(duì)缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有延遲保護(hù)效應(yīng)，使細(xì)胞凋亡減少，并且在本實(shí)驗(yàn)所規(guī)定的濃度范圍內(nèi)，隨著卡托普利濃度的增加此保護(hù)作用漸增強(qiáng)。但應(yīng)用HOE140阻斷劑、PKC阻斷劑、NOS阻斷劑和NF-kB阻斷劑，分別與卡托盡管作普利共同孵育細(xì)胞,再對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞行H/R損傷，可見(jiàn)卡托普利對(duì)H/R損傷導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的晚期保護(hù)效應(yīng)部分消失。證明卡托普利是通過(guò)激活緩激肽B2受體、PKC途徑、NOS合成以及核因子的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，抑制細(xì)胞凋亡的，但其具體作用靶點(diǎn)仍有待于進(jìn)一步的研究。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族目前被認(rèn)為是與凋亡最為密切相關(guān)的一類蛋白酶，凋亡的發(fā)生是細(xì)胞中Caspase家族凋亡蛋白特異性活化的結(jié)果。其中Caspase-3、Caspase- 8、Caspase-9在細(xì)胞凋亡經(jīng)典途徑中的重要凋亡蛋白，在凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，而目前對(duì)卡托普利預(yù)處理與Caspase蛋白表達(dá)的關(guān)系研究在國(guó)內(nèi)外報(bào)道均未多見(jiàn)，故本實(shí)驗(yàn)根據(jù)以往的研究結(jié)果，采用免疫組化的方法來(lái)檢測(cè)Caspase-3、Caspase- 8、Caspase-9的蛋白表達(dá)來(lái)探討以下問(wèn)題：1 缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡途徑的研究。2.ACEI晚期預(yù)適應(yīng)抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)。以進(jìn)一步明確缺血再灌注損傷和ACEI晚期預(yù)適應(yīng)抑制細(xì)胞凋亡的的相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供新得理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。內(nèi) 容 提 要缺血再灌注損傷可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變和功能失調(diào)，進(jìn)而引起細(xì)胞發(fā)生一系列變化，例如細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增加、大量自由基產(chǎn)生、細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)、蛋白含量降低等變化，最終引起細(xì)胞死亡或凋亡。自從1986年Murry等首次發(fā)現(xiàn)預(yù)處理現(xiàn)象至今，缺血預(yù)適應(yīng)（IPC）的機(jī)制尚不十分明確，但多年的研究明確證實(shí)，IPC是最強(qiáng)大的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，其心臟保護(hù)作用主要表現(xiàn)在限制心梗范圍，減少惡性心律失常的發(fā)生和改善心功能等。藥物預(yù)處理研究的發(fā)展，避免了缺血的損傷，更符合醫(yī)學(xué)論理學(xué)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，IPC及其藥物預(yù)適應(yīng)對(duì)缺氧再灌注損傷的血管床亦有保護(hù)作用。但無(wú)論是缺血還是藥物預(yù)適應(yīng)，特別是晚期預(yù)適應(yīng)，其研究的重點(diǎn)多集中于對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)，而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞與缺血再灌注損傷的研究、預(yù)適應(yīng)特別是晚期預(yù)適應(yīng)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受缺血再灌注損傷的研究還不多見(jiàn)，僅少數(shù)實(shí)驗(yàn)涉及此方面的研究，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少用。在實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)建立血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注（缺氧復(fù)氧）損傷模型,以探討ACEI預(yù)適應(yīng)對(duì)血管內(nèi)皮的延遲保護(hù)作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：1. 缺氧復(fù)氧損傷引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的病理過(guò)程中，caspase-3,9被激活，并且隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，caspase-3，9表達(dá)逐漸增加，提示caspase-3,9參與了缺氧復(fù)氧損傷誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的病理過(guò)程；同時(shí)caspase-8表達(dá)在這個(gè)過(guò)程中無(wú)明顯變化，因而我們可以從中推測(cè)缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)線立體途徑進(jìn)行的。2. 卡托普利預(yù)處理組的Caspase表達(dá)變化與缺氧/復(fù)氧組相似，但明顯下降,有此可見(jiàn)，卡托普利預(yù)處理可以通過(guò)影響緩激肽B2受體、一氧化氮產(chǎn)生等多種途徑來(lái)降低caspase-3,9的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮血管內(nèi)皮的保護(hù)作用, 且此保護(hù)作用具有劑量依賴性。由此可見(jiàn)，卡托普利預(yù)處理對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用涉及多種機(jī)制。這對(duì)于維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能和內(nèi)分泌功能，減輕缺血后的炎癥反應(yīng)，維持血流穩(wěn)定和血管的緊張性調(diào)節(jié)具有重要意義。本研究將進(jìn)一步闡述卡托普利的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供新的作用空間。關(guān)鍵詞：細(xì)胞凋亡 卡托普利 Caspase-3,8,9 缺血再灌注損傷第一部分：缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡途徑的研究前言細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序化死亡，是由一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶（caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)（cascade）事件的結(jié)果，而caspase-3又被證實(shí)處于該級(jí)聯(lián)反映的下游，是凋亡的真正執(zhí)行者； caspase-8,9又分別做為細(xì)胞凋亡的兩條主要途徑中caspase-3的激活劑，故三者在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。而缺血在灌注損傷不但是心血管疾病中一種常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，而且也是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的主要原因之一，目前關(guān)于缺血再灌注損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究多集中于神經(jīng)元細(xì)胞和心肌細(xì)胞，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡機(jī)制了解不是很多。而且，缺血再灌注損傷可引起細(xì)胞凋亡已在大量實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)此不在重復(fù)，重點(diǎn)是通過(guò)對(duì)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧來(lái)模擬缺血再灌注損傷這一病理過(guò)程，并采用免疫組化的方法檢測(cè)caspase-3,8,9的表達(dá)，來(lái)進(jìn)一步探討和闡明缺血再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋的相關(guān)機(jī)制和caspase3,8,9在細(xì)胞凋亡中所起的作用。1 材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(RAK 日本) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS公司) 恒溫水浴箱(H2S-H 哈爾濱) 加樣器(Labsystem芬蘭)顯微鏡自動(dòng)暴光系統(tǒng)（（OLYMPUS pm20）超凈工作臺(tái)（SW-CT-EFD蘇州）低溫臺(tái)式離心機(jī)（AERMLE Z383K 德國(guó)） 1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（購(gòu)置中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）caspase-3,8,9單克隆鼠抗人抗體（Santa Cruz）辣根過(guò)氧化物酶兔抗鼠抗體（Santa Cruz）胰蛋白酶(trypsin)購(gòu)自Difco公司.高壓氮?dú)庖黄浚ㄉ虾１葰W西氣體工業(yè)有限公司）胎牛血清和DMEM合成培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。將干粉型DMEM培養(yǎng)基10g溶于三蒸水1000ml，在磁力攪拌器上混勻，過(guò)濾除菌，分裝于250ml鹽水瓶中4C保存。胎牛血清首次應(yīng)用時(shí)先56℃滅活30min。用時(shí)現(xiàn)配制成含15%胎牛血清的DMEM：取胎牛血清15ml, HEPES（1mmol/L）1ml，L谷氨酰胺（0.2mmol/L）1ml, 抗菌素液(青霉素10,000U/ml鏈霉素10,000g/ml)1ml, 加入DMEM82ml,然后用7.5%NaHCO3調(diào)PH至7.4。配制無(wú)血清DMEM：DMEM 96ml，加入HEPES、L谷氨酰胺、抗菌素液各1ml，然后用7.5%NaHCO3調(diào)PH至7.4。HanK’s緩沖液：NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·12H2O 0.13g，Na2CO3 0.35g，CaCl2 0.14g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖·H2O 10.9g，加三蒸水至1000ml，混勻后用NaHCO3調(diào)PH至7.4，過(guò)濾除菌，250ml瓶分裝，4℃保存。D-HanK’s緩沖液：NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·12H2O 0.13g，Na2CO3 0.35g，加三蒸水至1000ml，混勻后用NaHCO3調(diào)PH至7.4,高壓除菌，250ml瓶分裝，4℃保存。PBS緩沖液: NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.5g,加三蒸水至1000ml，混勻后用NaHCO3調(diào)PH至7.4，過(guò)濾除菌，250ml瓶分裝，4℃保存。缺氧液：Na2HPO4:0.9mmol/L；NaHCO3:6.0mmol/L ；CaCl2：1.8mmol/L；MgSO4:1.2mmol/L;乳酸鈉:40mmol/L;HEPES:10mmol/L; Nacl:98.5mmol;KCl:10.00mmol/L加三蒸水至1000ml，混勻后用NaHCO3調(diào)PH至7.4，過(guò)濾除菌，250ml瓶分裝，4℃保存。復(fù)氧液：Na2HPO4:0.9mmol/L；NaHCO3 ：20.0mmol/L ；CaCl2 ：1.8mmol/L；MgSO4:1.2mmol/L；glucose:55mmol/L；HEPES:10mmol/L; Nacl:129.5mmol；KCl:5.0 mmol/L加三蒸水至1000ml，混勻后用NaHCO3調(diào)PH至7.4，過(guò)濾除菌，250ml瓶分裝，4℃保存。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)（1）體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)呈“鵝卵石樣”鑲嵌排列，細(xì)胞長(zhǎng)滿后呈接觸抑制現(xiàn)象。（2）2-3d換液一次。換液時(shí)將原培養(yǎng)液棄掉1/2-2/3，然后加入新鮮的培養(yǎng)液至原來(lái)的量。待細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，即可傳代。（3）原代培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)溫的D-Hank’s液清洗2次。加入0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合消化液，正好形成一淺層液面將細(xì)胞覆蓋，室溫（20-25℃）下消化1-2min。（4）鏡下見(jiàn)細(xì)胞稍收縮變圓、細(xì)胞間隙增寬后，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，棄酶液?？稍儆肈-Hanks液輕輕洗1次。加入IMDM培養(yǎng)液（pH7.2、100IU/ml青霉素、100g/ml鏈霉素）和10%胎牛血清。（5）用彎頭吸管吸取培養(yǎng)液，輕輕將細(xì)胞吹打下來(lái)。調(diào)整細(xì)胞密度至大約1.5×105個(gè)/ml。按實(shí)驗(yàn)需要接種到新的培養(yǎng)瓶或其他培養(yǎng)皿中。一般按1：2或1：3的比例傳代（即1瓶傳2-3瓶）。（6）內(nèi)皮細(xì)胞多次傳代后，其形態(tài)和生物學(xué)特性會(huì)有所改變，故不宜做長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。如實(shí)驗(yàn)需要可重復(fù)從原代建立培養(yǎng)。因此，一般不做冷凍和復(fù)蘇處理。1.2.2 臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞記數(shù) 細(xì)胞記數(shù)對(duì)于決定植入的細(xì)胞濃度和數(shù)量以及了解細(xì)胞存活率和增殖度都是極為重要的。首先取待測(cè)的細(xì)胞懸液0.1ml加D-Hank’s0.8ml及0.3%臺(tái)盼藍(lán)0.1ml（死細(xì)胞著色），混合后滴入血球記數(shù)盤內(nèi)，按白細(xì)胞記數(shù)法，于低倍鏡下計(jì)數(shù)4角的4個(gè)大格內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)（透明未著色者），然后按下式記數(shù)：細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/ml）=（4個(gè)大格內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)（10）細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%1.2.3缺氧復(fù)氧模型的建立取培養(yǎng)至第3代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用缺氧液換液，95%氮?dú)狻?7℃培養(yǎng)不同時(shí)間后，再以復(fù)氧液全量換液，并恢復(fù)5%CO2氣體環(huán)境正常培養(yǎng)，建立缺氧復(fù)氧模型。1.2.4實(shí)驗(yàn)分組與方案 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分兩組：（1）對(duì)照組（C）：細(xì)胞置IMDM培養(yǎng)基中于5%CO2、370℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng) （2）缺氧復(fù)氧組（H/R）：細(xì)胞于缺氧液、100%氮?dú)狻?7℃條件下培養(yǎng)2小時(shí)后，全量換以復(fù)氧液，并恢復(fù)5%CO2氣體環(huán)境分別培養(yǎng)1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)，4小時(shí)。1.3 Caspase—3，8，9表達(dá)測(cè)定：采用免疫組化染色的方法：收集以上各組細(xì)胞，于4℃多聚甲醛固定后過(guò)夜，再用0.5%H2O2—甲醇液處理30分鐘（封閉細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物），再浸入到PBS中洗3×5分鐘，滴加5%—10%的正常動(dòng)物血清，室溫，放濕盒中封閉30分鐘，滴加一抗，濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，再浸入到PBS中洗3×5分鐘，滴加二抗，37℃，30分鐘，浸入到PBS中洗3×5分鐘，加入避光顯色5—10分鐘（室溫），光鏡下控制反應(yīng)強(qiáng)度（棕色），浸入到PBS中洗3×5分鐘，終止反應(yīng)，經(jīng)80%，90%，2×100%乙醇溶液脫水，二甲苯透明，每步1分鐘，室溫放置數(shù)分鐘，使二甲苯完全蒸發(fā)掉，最后滴加1滴封片液。1.4 細(xì)胞記數(shù)：在培養(yǎng)孔邊緣統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和中心之間的位置隨機(jī)選取4個(gè)區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)并取平均值，每個(gè)區(qū)域記數(shù)約200個(gè)細(xì)胞，每組有4個(gè)平行孔，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比.1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各種計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)間顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較及兩兩比較采用ANOVA，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS軟件包。P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1對(duì)照組的Caspase蛋白表達(dá)：對(duì)照組的細(xì)胞染色均很微弱，說(shuō)明正常條件下Caspase-3,8,9的蛋白基本無(wú)明顯表達(dá)，表明Caspase-3,8,9在正常條件下活性低下。2.2缺氧復(fù)氧組的Caspase蛋白表達(dá)：與對(duì)照組相比,缺氧/復(fù)氧組中檢測(cè)Caspase-3,9蛋白表達(dá)的細(xì)胞的染色明顯，各組相比P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義這說(shuō)明缺氧/復(fù)氧損傷使血管內(nèi)皮細(xì)胞的Caspase-3,9蛋白表達(dá)明顯增加，；而檢測(cè)Caspase-8蛋白表達(dá)的細(xì)胞染色無(wú)明顯染色，各組相比P>0.05差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明Caspase-8在缺氧復(fù)氧損傷中沒(méi)有明顯表達(dá)，即沒(méi)有參與這一病理過(guò)程。2.3Caspase蛋白表達(dá)的時(shí)間依賴性：缺氧復(fù)氧組的血管內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3,9的表達(dá)隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)一步增加直到復(fù)氧四小時(shí)而達(dá)到頂峰。（表1）（附圖1）Table1 Changes of caspase-3.8.9 expression on HUVEC induced by hypoxia/reoxygenation groupCaspase expression positive cells % Caspase-3 casepase-8 casepase-9Control group 5.6±1.2* 3.3±1.4 6.4±2.2*hypoxia/reoxygenation1.0h 12.8±2.4* 3.2±2.2 22.6±2.4*hypoxia/reoxygenation2.0h 20.5±3.2* 3.6±2.6 32.8±1.8*hypoxia/reoxygenation3.0h 38.8±2.2* 3.5±2.1 42.2±3.2*hypoxia/reoxygenation4.0h 47.2±2.6* 3..8±1.6 52.8±2.6*The expression of caspase-3,8,9 were detected by immunocytochemistry. the Caspase-3、9 were activated in HUVEC during hypoxia /reoxygenation and expression of caspase-3,9 were significantly increased fol lowed the time of reoxygenation extending;but expression of caspase-8 have no changes in HUVEC during hypoxia/ reoxyge nation.3.討論缺血和缺氧有著極其相似的病理改變和發(fā)病機(jī)制，故設(shè)計(jì)利用培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧復(fù)氧模型來(lái)模擬缺血再灌注損傷模型，旨在研究缺血再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制及Caspase家族相關(guān)的蛋白酶的表達(dá)變化。為了更好的模擬在體時(shí)細(xì)胞的缺血再灌注狀態(tài)，在缺氧時(shí)我們采用缺氧液培養(yǎng)細(xì)胞，除造成缺氧外，同時(shí)限制糖，鈣及液體量，而在復(fù)氧時(shí)則用含糖，鈣的復(fù)氧液，并給予充分的氧，以滿足再灌注的條件。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組的HUVEC的Caspase-9僅低水平表達(dá)，但實(shí)驗(yàn)組在缺氧兩小時(shí)后再進(jìn)行復(fù)氧的過(guò)程中，在復(fù)氧早期Caspase—9，表達(dá)即開(kāi)始增加，并隨著復(fù)氧的時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在復(fù)氧四小時(shí)達(dá)到頂峰。這無(wú)疑提示Caspase—9在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)HUVEC凋亡這一病理過(guò)程中被激活并參與了這一病理過(guò)程。細(xì)胞凋亡是由于細(xì)胞程內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號(hào)觸發(fā)以及在基因調(diào)控下所引起細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程，這一過(guò)程一般要經(jīng)歷啟始階段、效應(yīng)階段和降解階段（Initiation phase、Effect phase and Degradation phase）三個(gè)階段[3]。啟始階段時(shí)，細(xì)胞受到來(lái)自外界的各類凋亡信號(hào)的刺激以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列生化反應(yīng)；效應(yīng)階段時(shí)，細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行各種生化反應(yīng)而形成細(xì)胞凋亡的一條或數(shù)條信號(hào)傳導(dǎo)通路，其中包括必須的四大關(guān)鍵元件：線粒體，Caspase ，bcl-2s和Apaf-1。最終細(xì)胞進(jìn)入降解階段時(shí)，多種水解酶（包括特異性蛋白酶Caspase 和核酸酶）被活化，細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為DNA的降解，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞體積縮小，質(zhì)膜發(fā)泡，最終細(xì)胞裂解，凋亡小體形成并被周邊吞噬細(xì)胞吞噬降解。由此可見(jiàn)，Caspase家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著極為重要的作用。Caspase家族的分子量在30-50KD之間，包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域：氨基端的原域、大亞單位（約20KD）、和小亞單位（約10KD）。根據(jù)它們之間大小亞單位序列的同源性以及功能，可分為三組[4]：（1）細(xì)胞因子處理組：Caspase-1、-4、-5、-11、-12、-13和-14；（2）凋亡起始組：Caspase-2、-8、-9和-10（3）：凋亡效應(yīng)組：Caspase-3、-6和-7。細(xì)胞因子處理組和起始組Caspase酶原都含有較長(zhǎng)的原域，長(zhǎng)原域中包含有死亡效應(yīng)域（DED）或Caspase募集域（CARD）。DED和CARD的結(jié)構(gòu)與死亡域(DD)相似，都屬于死亡域超家族。這些區(qū)域通過(guò)蛋白-蛋白的相互作用從而在Caspase酶原的激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用。相比之下，效應(yīng)組Caspase的原域很短，不可能通過(guò)這種方式激活。除此之外，Caspase還具備以下特點(diǎn)（1）：它是一種半胱氨酸蛋白酶，用半胱氨酸作為裂解底物的親核集團(tuán)（2）：其催化活性對(duì)底物的天冬氨酸有特異的要求，既催化時(shí)使底物的天冬氨酸殘基羧基端的肽鍵斷裂（3）：Caspase以活性很低的酶原形式合成，通過(guò)蛋白酶水解去處氨基端的一段序列而被激活。（4）：活化的Caspase能夠特異性地水解一套底物，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，此過(guò)程為不可逆反應(yīng)。（5）：正常情況下，細(xì)胞內(nèi)Caspase與其抑制劑總是共存的，以免Caspase酶原被意外激活，對(duì)正常細(xì)胞造成損傷。正是這種Caspase家族組成的復(fù)雜性和獨(dú)特的生物學(xué)特性才決定了不同的細(xì)胞含有不同的Caspase群體，不同的刺激激活不同的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，由不同的Caspase參與信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，故發(fā)生細(xì)胞凋亡的機(jī)制也不盡相同。在本實(shí)驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)在復(fù)氧早期Caspase—3蛋白表達(dá)即開(kāi)始增加，并隨著復(fù)氧的時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在復(fù)氧四小時(shí)達(dá)到頂峰。這無(wú)疑提示Caspase—3在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)HUVEC凋亡這一病理過(guò)程中被激活并參與了這一病理過(guò)程。這與[MatsushitaH] [5]所進(jìn)行的缺氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。Caspase-3基因（CASP-3）最初在人類Jurkat-T淋巴細(xì)胞中被克隆出的，該基因編碼一個(gè)分子量為32KD的半胱氨酸蛋白酶CPP32，其活性中心和結(jié)合底物相關(guān)的保守氨基酸序列均與白細(xì)胞介素—Iβ轉(zhuǎn)化酶（IEC）一致。其后，等研究發(fā)現(xiàn)CPP32酶原含有凋亡素，它由分子量為17KD和12KD的大小2個(gè)亞基組成，[Nicholson]等把它命名為Caspase-3[6]。在Caspase-3酶原中存在一安全扣調(diào)解三肽，由“Asp-Asp-Asp”組成，位于大小亞基結(jié)合處可變形的環(huán)區(qū)中，凋亡發(fā)生時(shí)該三肽殘基在胞漿內(nèi)被酸化裂解，在Caspase-3的觸發(fā)活化是起關(guān)鍵作用，因而它可能是整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)[7] 。正常情況下，Caspase-3是以休眠狀態(tài)的酶原形式存在于正常細(xì)胞中，酶原的N端有一前區(qū)（prodomain），與Caspase-8、9等起始型Caspase相比，其前區(qū)較短，不含有DED，必須在起始型Caspase被激活后才能進(jìn)一步被激活[8]。Caspase-3的激活主要是通過(guò)兩條細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)行的：1死亡受體途徑[9]: 死亡受體屬于腫瘤因子受體(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞內(nèi)部分含有一個(gè)死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配體是一個(gè)同源三聚體，每個(gè)三聚體分子結(jié)合3個(gè)Fas分子。一旦與三聚體的配體相結(jié)合，F(xiàn)as通過(guò)胞內(nèi)段的DD和FADD羧基端的DD之間的相互作用，募集胞質(zhì)中的銜接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas區(qū)域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增強(qiáng)，而自我剪切活化 。活化的Caspase-8釋放到細(xì)胞質(zhì)中即激活Caspase—3；2：線粒體通路[10]：各種促凋亡信號(hào)如DNA損傷、生長(zhǎng)因子去除等誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C。在ATP/dATP存在的情況下，細(xì)胞色素C結(jié)合到Apaf-1的WD40重復(fù)區(qū)域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-細(xì)胞上色素C多聚復(fù)合體。此復(fù)合體通過(guò)Apaf-1的氨基端的CARD與Caspase-9原域的CARD之間的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞質(zhì)的Caspase—9。Caspase—9酶原之間因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作為起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3。Caspase—3激活時(shí)在Asp（pl）-x位置切開(kāi)，形成大小亞基（α和β），同時(shí)去掉其N端的前區(qū)，進(jìn)而α與β結(jié)合形成異二聚體（17KD-12KD）[11]，酶的兩個(gè)活性位點(diǎn)位于大小亞基的結(jié)合部，異二聚體還將進(jìn)一步通過(guò)次級(jí)鍵形成四級(jí)結(jié)構(gòu)（α/β）2發(fā)揮作用。Caspase酶原被剪切而發(fā)揮作用時(shí)，其辨認(rèn)序列從N端到切割位點(diǎn)至少要4個(gè)氨基酸，而且P1位點(diǎn)必須是Asp（D）。一旦Caspase—3被激活，其本身至少?gòu)娜齻€(gè)方面導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]：（1）分解凋亡保護(hù)蛋白，如凋亡抑制性蛋白bcl-2家族（2）直接解聚細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如分解細(xì)胞骨架蛋白（α-spectrin, β-spectrin,actin,tau蛋白等）和調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的蛋白gelsolin。（3）使細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制和修復(fù)的蛋白酶失活或下調(diào)，而且激活其他的Caspase并且放大Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時(shí)我們還從實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Caspase—8的表達(dá)在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的整個(gè)過(guò)程中，無(wú)明顯變化，這說(shuō)明Caspase-3的激活主要是通過(guò)線粒體途徑由Caspase-9激活的，而不是通過(guò)細(xì)胞的死亡受體途徑由Caspase-8激活的。這也進(jìn)一步說(shuō)明缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，氧自由基大量產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)鈣超載等多種機(jī)制引起線粒體的跨膜電位崩解，激發(fā)了細(xì)胞凋亡的線粒體途徑而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。4.結(jié)論 在缺氧復(fù)氧損傷誘導(dǎo)HUVEC凋亡的過(guò)程中， Caspase-3，-9蛋白表達(dá)明顯增加，并隨著復(fù)氧的時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在復(fù)氧四小時(shí)達(dá)到頂峰。這說(shuō)明Caspase-3， Caspase—9參與了缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)HUVEC凋亡這一病理；同時(shí)Caspase—8的蛋白表達(dá)在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的整個(gè)過(guò)程中，無(wú)明顯變化，從中我們可以推測(cè)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)線粒體途徑進(jìn)行的。第二部分 ACEI預(yù)適應(yīng)對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時(shí)caspase-3,8,9的影響及機(jī)制前言 IPC作為體內(nèi)最強(qiáng)大的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，在缺血再灌注損傷中的作用已是不爭(zhēng)的事實(shí)，IPC的保護(hù)作用不僅存在于器官水平，而且存在于細(xì)胞水平；不僅可以保護(hù)心肌細(xì)胞，還可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。然而，缺血本身是一種損傷，實(shí)施損傷性預(yù)處理由于倫理觀念臨床上還難以接受，故藥物性預(yù)處理具有重要的研究?jī)r(jià)值?？ㄍ衅绽堑谝粋€(gè)口服有效的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，自從1981年由美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療高血壓以來(lái)，卡托普利在治療充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重構(gòu)和糖尿病腎病中取得了良好的療效。它在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中應(yīng)用范圍最廣[13]。隨著相關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)的迅猛發(fā)展和對(duì)卡托普利藥理作用研究的深入，近來(lái)人們?cè)诖罅康膭?dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)卡托普利具有藥物預(yù)處理的作用。 缺血再灌注損傷不但是心血管疾病中一種常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，而且也是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度凋亡的主要原因之一，這已在大量的實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)，但對(duì)其發(fā)生機(jī)制的闡明還缺乏明確闡述。而且關(guān)于缺血及再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究,目前主要集中在神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞,對(duì)VEC的研究較少。此外血管內(nèi)皮細(xì)胞作為一個(gè)具有多種生物活性的器官，具有重要的生理功能，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)度既是內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)的始動(dòng)環(huán)節(jié)，也是冠心病發(fā)生和發(fā)展的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，也是不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死等急性心臟事件的促發(fā)環(huán)節(jié)，而且還能抑制心臟急性缺血后的血管再生，妨礙其功能的恢復(fù)。故研究缺血再灌注損傷導(dǎo)致VEC發(fā)生凋亡的機(jī)制,明確有效的阻斷位點(diǎn)并加以阻斷,對(duì)保護(hù)VEC,治療缺血缺氧性疾病有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注（缺氧復(fù)氧）損傷模型,探討ACEI預(yù)適應(yīng)對(duì)血管內(nèi)皮的延遲保護(hù)作用機(jī)制，為其抗缺血再灌注損傷作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(RAK 日本) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS公司) 恒溫水浴箱(H2S-H 哈爾濱) 加樣器(Labsystem芬蘭)顯微鏡自動(dòng)暴光系統(tǒng)（（OLYMPUS pm20）超凈工作臺(tái)（SW-CT-EFD蘇州）低溫臺(tái)式離心機(jī)（AERMLE Z383K 德國(guó)） 1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（購(gòu)置中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）caspase-3,9單克隆鼠抗人抗體（Santa Cruz）辣根過(guò)氧化物酶兔抗鼠抗體（Santa Cruz）胰蛋白酶(trypsin)購(gòu)自（Difco公司.）卡托普利純品（中美上海施貴寶公司饋贈(zèng)）高壓氮?dú)庖黄浚ㄉ虾１葰W西氣體工業(yè)有限公司）胎牛血清和DMEM合成培養(yǎng)基購(gòu)自(Sigma Chemical Co.USA)HanK’s緩沖液，D-HanK’s緩沖液PBS緩沖液缺氧液，復(fù)氧液1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)（1）體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)呈“鵝卵石樣”鑲嵌排列，細(xì)胞長(zhǎng)滿后呈接觸抑制現(xiàn)象。（2）2-3d換液一次。換液時(shí)將原培養(yǎng)液棄掉1/2-2/3，然后加入新鮮的培養(yǎng)液至原來(lái)的量。待細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，即可傳代。（3）原代培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)溫的D-Hank’s液清洗2次。加入0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合消化液，正好形成一淺層液面將細(xì)胞覆蓋，室溫（20-25℃）下消化1-2min。（4）鏡下見(jiàn)細(xì)胞稍收縮變圓、細(xì)胞間隙增寬后，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，棄酶液。可再用D-Hanks液輕輕洗1次。加入IMDM培養(yǎng)液（pH7.2、100IU/ml青霉素、100g/ml鏈霉素）和10%胎牛血清。（5）用彎頭吸管吸取培養(yǎng)液，輕輕將細(xì)胞吹打下來(lái)。調(diào)整細(xì)胞密度至大約1.5×105個(gè)/ml。按實(shí)驗(yàn)需要接種到新的培養(yǎng)瓶或其他培養(yǎng)皿中。一般按1：2或1：3的比例傳代（即1瓶傳2-3瓶）。（6）內(nèi)皮細(xì)胞多次傳代后，其形態(tài)和生物學(xué)特性會(huì)有所改變，故不宜做長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。如實(shí)驗(yàn)需要可重復(fù)從原代建立培養(yǎng)。因此，一般不做冷凍和復(fù)蘇處理。1.2.2 臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞記數(shù) 細(xì)胞記數(shù)對(duì)于決定植入的細(xì)胞濃度和數(shù)量以及了解細(xì)胞存活率和增殖度都是極為重要的。 首先取待測(cè)的細(xì)胞懸液0.1ml加D-Hank’s0.8ml及0.3%臺(tái)盼藍(lán)0.1ml（死細(xì)胞著色），混合后滴入血球記數(shù)盤內(nèi)，按白細(xì)胞記數(shù)法，于低倍鏡下計(jì)數(shù)4角的4個(gè)大格內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)（透明未著色者），然后按下式記數(shù)：細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/ml）=（4個(gè)大格內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)（10）細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%1.2.3缺氧復(fù)氧模型的建立取培養(yǎng)至第3代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用缺氧液換液，95%氮?dú)狻?7℃培養(yǎng)不同時(shí)間后，再以復(fù)氧液全量換液，并恢復(fù)5%CO2氣體環(huán)境正常培養(yǎng)，建立缺氧復(fù)氧模型。1.2.4實(shí)驗(yàn)分組與方案 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分三組：（1）對(duì)照組（C）：細(xì)胞于IMDM培養(yǎng)基中于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng) （2）缺氧復(fù)氧組（H2/R4）：細(xì)胞于缺氧液、100%氮?dú)狻?7℃條件下培養(yǎng)2小時(shí)后，全量換以復(fù)氧液，并恢復(fù)5%CO2氣體環(huán)境培養(yǎng)4小時(shí)。（4）卡托普利預(yù)處理組（CAP）：不同濃度的卡托普利（10-2、10-3、10-4mol/L）預(yù)處理24小時(shí)后，對(duì)EC行缺氧2小時(shí)復(fù)氧4小時(shí)（H2/R4）方案。1.3 Caspase—3，9蛋白表達(dá)測(cè)定：采用免疫組化染色的方法：收集以上各組細(xì)胞，于4℃多聚甲醛固定后過(guò)夜，再用0.5%H2O2—甲醇液處理30分鐘（封閉細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物），再浸入到PBS中洗3×5分鐘，滴加5%—10%的正常動(dòng)物血清，室溫，放濕盒中封閉30分鐘，滴加一抗，濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，再浸入到PBS中洗3×5分鐘，滴加二抗，37℃，30分鐘，浸入到PBS中洗3×5分鐘，加入避光顯色5—10分鐘（室溫），光鏡下控制反應(yīng)強(qiáng)度（棕色），浸入到PBS中洗3×5分鐘，終止反應(yīng)，經(jīng)80%，90%，2×100%乙醇溶液脫水，二甲苯透明，每步1分鐘，室溫放置數(shù)分鐘，使二甲苯完全蒸發(fā)掉，最后滴加1滴封片液。1.4 細(xì)胞記數(shù)在培養(yǎng)孔邊緣統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和中心之間的位置隨機(jī)選取4個(gè)區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)并取平均值，每個(gè)區(qū)域記數(shù)約200個(gè)細(xì)胞，每組有4個(gè)平行孔，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比.1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各種計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)間顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較及兩兩比較采用ANOVA，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS軟件包。P<0.05為差異有顯著性。2. 結(jié)果2.1卡托普利最適濃度的篩選待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%匯合以后,各組分別加入10-1mol/l，10-2mol/l、10-3 mol/l、10-4 mol/l 、10-5 mol/l 、10-6 mol/l 作用24小時(shí),觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。收集全部的貼壁和漂浮細(xì)胞,用臺(tái)盼藍(lán)染色后在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞因其細(xì)胞膜的完整性而對(duì)臺(tái)盼藍(lán)拒染,死細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色?；罴?xì)胞百分?jǐn)?shù)=未著色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)(著色細(xì)胞數(shù)+未著色細(xì)胞數(shù))。以細(xì)胞生長(zhǎng)不受影響而卡托普利濃度達(dá)最高時(shí)的濃度作為實(shí)驗(yàn)最大濃度。2.2 Caspase蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果2.2.1對(duì)照組的Caspase蛋白表達(dá)：對(duì)照組的細(xì)胞染色均很微弱，說(shuō)明正常條件下內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3,9的蛋白基本無(wú)明顯表達(dá)，同時(shí)也說(shuō)明Caspase-3,9在正常條件下活性低下。2.2.2卡托普利預(yù)處理組的Caspase蛋白表達(dá)：與正常對(duì)照組細(xì)胞微弱的染色相比, 卡托普利預(yù)處理組的細(xì)胞細(xì)胞染色有所增加，與缺氧/復(fù)氧組的細(xì)胞染色相比則明顯減少，各組細(xì)胞染色相比P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明缺氧/復(fù)氧損傷使血管內(nèi)皮細(xì)胞的Caspase-3,9蛋白表達(dá)明顯增加，而卡托普利預(yù)處理可以明顯降低凋亡細(xì)胞的Caspase-3,9蛋白表達(dá)。2.2.3 Caspase蛋白表達(dá)的時(shí)間依賴性：卡托普利預(yù)處理組的Caspase3、9的表達(dá)且隨著卡托普利濃度的增加而逐漸降低，這種抑制作用與卡托普利的濃度具有量-效關(guān)系。并隨著卡托普利濃度的增加而Caspase-3,9的表達(dá)降低越明顯，三者相比P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.。（表2）（附圖2）Table2 Effect of on caspase-3.8.9 expression on HUVEC induced by hypoxia/reoxygenation and preconditioning with captoprilgroup Caspase expression positive cells % Caspase-3 Casepase-9 Control group 4.6±1.9* 5.2±2.8* H2/R4 47.8±2.4* 62.6±2.4* H2/R4 +capotril(10-4) mmol/L 39.2±2.2* 48.6±3.8* H2/R4 +capotril(10-3) mmol/L 30.8±3.6* 39.2±2.8* H2/R4 +capotril(10-2) mmol/L 20.4±2.8* 27.8±3.5* The expression of caspase-3,9 were detected by immunocytochemistry.the Caspase-3、9 were activated in HUVEC during hypoxia/reoxygenation， expression of caspase-3.9 in HUVEC preconditioning with catopril were significantly decreased in contrast with hypoxia/reoxygenation group and significantly decreased followed the catopril concentration increasing.3討論本實(shí)驗(yàn)在離體培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上，給予不同濃度的卡托普利處理后進(jìn)行缺氧復(fù)氧損傷，從中發(fā)現(xiàn)卡托普利預(yù)處理組的Caspase3、9表達(dá)明顯低于缺氧復(fù)氧組，且隨著卡托普利濃度的增加而逐漸降低，這說(shuō)明卡托普利具有抑制Caspase蛋白表達(dá)的作用，并且這種抑制作用與卡托普利的濃度具有量-效關(guān)系。缺血再灌注損傷是一種常見(jiàn)的臨床病理生理過(guò)程，與心肌梗死，心絞痛等心血管疾病密切相關(guān)，故一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血液與組織之間，是各血管組織缺血及再灌注損傷過(guò)程中最先受損的部位，大量的在體和離體實(shí)驗(yàn)均以證實(shí)缺血再灌注可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[13-16]。細(xì)胞凋亡不但是缺血再灌注損傷的特征之一，而且細(xì)胞凋亡可以加重缺血再灌注損傷，細(xì)胞凋亡的多少?zèng)Q定了缺血再灌注損傷的輕重。故通過(guò)研究VEC缺氧復(fù)氧損傷性凋亡的機(jī)制和卡托普利預(yù)適應(yīng)的VEC保護(hù)作用來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)治療缺血缺氧性疾病有重要的理論和臨床意義。細(xì)胞凋亡可在四個(gè)水平被抑制,即干擾凋亡的刺激因素、在受體/配體水平的功能性拮抗、阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制催化性酶,如Caspase、核酸內(nèi)切酶等。目前，對(duì)缺氧再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及卡托普利預(yù)處理的保護(hù)機(jī)制尚不十分明確。考慮可能與以下幾種因素相關(guān)：（1）氧自由基：我們以往的實(shí)驗(yàn)證實(shí)單純?nèi)毖鹾腿毖鯊?fù)氧均可產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基，它可能通過(guò)以下幾種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋[16]。①直接損傷DNA，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。②攻擊蛋白質(zhì)，使許多蛋白尤其是具有酶活性的蛋白功能喪失。③影響核基因轉(zhuǎn)錄，改變細(xì)胞表型特征，誘導(dǎo)凋亡。④直接作用于細(xì)胞質(zhì)膜，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，最終激活Caspase蛋白及有關(guān)調(diào)控凋亡的基因，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而經(jīng)過(guò)卡托普利預(yù)處理后的內(nèi)皮細(xì)胞，由于卡托普利本身含有巰基（SH），不但具有抑制微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及白細(xì)胞產(chǎn)生氧自自由基的作用，而且本身是強(qiáng)有力的氧自由基清除劑。Tambd[17]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利對(duì)缺血再灌注過(guò)程中產(chǎn)生氧自由基所至的細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，這與我國(guó)學(xué)者胡青松等[18]研究發(fā)現(xiàn)卡托普利具有抑制羥自由基誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞凋亡的結(jié)論相一致。由此可見(jiàn)，卡托普利通過(guò)抑制和清除氧自由基的雙重作用來(lái)阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇P所致T孔開(kāi)放，此外卡托普利所含有巰基（SH）也可使PT孔處于關(guān)閉狀態(tài)，穩(wěn)定了線粒體膜電位，阻止Cyt-C及凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）從線粒體中釋放，有效降低了缺血再灌注損傷過(guò)程中Caspase3、9的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。（2）各種凋亡相關(guān)基因的作用：①Bcl-2家族：Bcl-2家族由兩類功能相反的蛋白組成,Bcl-2、Bcl-XL、A1及Mcl-1抑制凋亡,而Bax、Bcl-Xs、Bad和Bak促進(jìn)凋亡。Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用主要是通過(guò)線粒體依賴性途徑實(shí)現(xiàn)：Bcl-2蛋白可以在線粒體膜形成陽(yáng)離子通道，它插入到線粒體膜后通過(guò)質(zhì)子流動(dòng)和電壓依賴性陰離子通道（VDAC）來(lái)抑制滲透性轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放，從而防止細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等促凋亡因子從線粒體釋放，阻止了Caspase-3、9的激活，最終抑制細(xì)胞凋亡[19-20]。此外Bcl-2還可以直接與胞漿中Caspase-9連接的Apaf-1相結(jié)合而存在于線粒體外膜，通過(guò)形成線粒體—Bcl-2—Apaf-1—Caspase-9的四聚復(fù)合物的形式對(duì)Apaf-1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，使Apaf-1失去對(duì)Caspase酶系的活化從而抑制細(xì)胞凋亡[21]。Matsushita研究小組證明,缺氧處理可使內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2水平明顯降低,而Bax水平?jīng)]有變化,抗凋亡蛋白Bcl-2水平的降低與細(xì)胞凋亡相關(guān)[8]。對(duì)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究也發(fā)現(xiàn)缺氧再灌注可使Bcl-2水平降低[22]，而Stempien-Otero等發(fā)現(xiàn)在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧性凋亡時(shí),Bax和Bcl-XL水平均未發(fā)生變化,Bax/Bcl-XL的比例似乎與細(xì)胞凋亡并無(wú)相關(guān)[23]。從中我們可以推測(cè)Bcl-2的水平降低在缺血再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的病理過(guò)程中起著重要作用。同時(shí)Liangxuguo[24]等應(yīng)用卡托普利和氯沙坦干預(yù)由血管緊張素II（AngII）所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，還能降低促凋亡基因表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而抑制Caspase-9的激活并阻斷了Caspase-3激活所依賴的線粒體途徑，減少了Caspase-3的活化而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。（3）AngII與其相應(yīng)的受體AT1結(jié)合并共同作用，在增加AT1受體蛋白的表達(dá)的同時(shí)并明顯上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，進(jìn)而激活caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25]；而卡托普利通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，阻止了AngI轉(zhuǎn)換為AngII，從而不但使AngII所產(chǎn)生的氧自由基和炎性介質(zhì)減少，而且部分阻斷AngII與其相應(yīng)受體結(jié)合所至的細(xì)胞凋亡作用。同時(shí)，還能降低促凋亡基因表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從分子水平發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用[24]。此外卡托普利還能通過(guò)減少緩激肽的降解，使增加的緩激肽通過(guò)與其β2受體結(jié)合,進(jìn)而激活磷酸酯酶C(PLC),產(chǎn)生的IP3使細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放而一氧化氮合酶（NOS）和上調(diào)ecNOS，從而增加一氧化氮（NO）的產(chǎn)生[26]，而一氧化氮可以通過(guò)半胱氨酸的S亞硝基化來(lái)抑制caspase-3的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡[27-28]．Fnjita N[29]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，內(nèi)皮細(xì)胞提前經(jīng)ACEI類藥物和緩激肽處理后可以明顯減少H/R引起的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和乳酸脫氫酶的釋放，且此作用可以被B2受體阻斷劑和一氧化氮合酶抑制劑取消，從而證明，ACEI可以通過(guò)上調(diào)緩激肽水平從而使一氧化氮合酶活性增加，提高NO的釋放，從而達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，缺氧再灌注損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是可以干預(yù)的，從而提示我們可以從減輕細(xì)胞凋亡的角度預(yù)防缺氧再灌注損傷對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的破壞。即通過(guò)清除凋亡誘發(fā)因素，抑制凋亡的信息傳導(dǎo)通路，減少細(xì)胞損傷，這將會(huì)為保護(hù)缺氧再灌注損傷提供新的治療途徑，具有重要的治療價(jià)值。結(jié) 論 本實(shí)驗(yàn)證明，卡托普利晚期預(yù)處理后，內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧復(fù)氧損傷過(guò)程中，Caspase3，9的表達(dá)明顯降低，且與卡托普利的濃度具有量-效關(guān)系。結(jié)合進(jìn)一步的研究我們分析，卡托普利預(yù)處理可以通過(guò)激活緩激肽B2受體、清除氧自由基、上調(diào)bcl-2的表達(dá)等多種機(jī)制來(lái)抑制Caspase3，9在內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷期間的激活從而發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。同時(shí)亦表明卡托普利對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用至少是部分通過(guò)降低Caspase-3、9的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。參考文獻(xiàn)[1]. 宋秋景 李建元。缺血預(yù)適應(yīng)的研究現(xiàn)狀和前景。 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2000，14（1）：1-7.[2].Pomerantz B J,Joo K,Shames B D,et al.Andenosine 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Inhibition of angiotension-converting enzyme protects endothelial cell against hypoxia/ reoxygenation injury. Biofactors, 2001; 11(4):257-266本研究先進(jìn)性1．本實(shí)驗(yàn)根據(jù)缺血和缺氧有著極其相似的病理改變和發(fā)病機(jī)制，故設(shè)計(jì)以培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧復(fù)氧模型來(lái)模擬缺血再灌注損傷模型，而且為了更好的模擬在體時(shí)細(xì)胞的缺血再灌注狀態(tài)，在缺氧時(shí)我們采用缺氧液培養(yǎng)細(xì)胞，除造成缺氧外，同時(shí)限制糖，鈣及液體量，而在復(fù)氧時(shí)則用含糖，鈣的復(fù)氧液，并給予充分的氧，以滿足再灌注的條件。2．本實(shí)驗(yàn)依細(xì)胞凋亡的經(jīng)典途徑為基礎(chǔ)，通過(guò)檢測(cè)凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵酶Caspase3、8、9，來(lái)研究缺血再灌注損傷導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。3．缺氧和缺氧復(fù)氧均可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的Caspase3、9表達(dá)，且表達(dá)程度與缺氧復(fù)氧損傷時(shí)間具有顯著的依賴性，這說(shuō)明Caspase-3， Caspase—9參與了缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)HUVEC凋亡這一病理；4．同時(shí)Caspase—8的表達(dá)在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的整個(gè)過(guò)程中，無(wú)明顯變化，從中我們可以推測(cè)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)線粒體途徑進(jìn)行的。這將有助于為尋找適當(dāng)?shù)闹委煱悬c(diǎn)提供理論參考。5卡托普利晚期預(yù)處理可以降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的Caspase3、9表達(dá)，此種抑制作用具有劑量依賴性。6卡托普利晚期預(yù)處理可以通過(guò)激活緩激肽B2受體、清除氧自由基、上調(diào)bcl-2的表達(dá)等多種機(jī)制來(lái)抑制Caspase3，9在內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷期間的激活從而發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。同時(shí)亦表明卡托普利對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用至少是部分通過(guò)降低Caspase-3、9的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。中文摘要缺血再灌注損傷的防治一直是心血管領(lǐng)域研究的重點(diǎn)課題。缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditionging，IPC）是體內(nèi)最強(qiáng)大的保護(hù)機(jī)制，是一種多元性細(xì)胞防御現(xiàn)象。IPC的保護(hù)作用不僅存在于器官水平，而且存在于細(xì)胞水平，不僅可以保護(hù)心肌細(xì)胞，而且可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為缺血心肌的保護(hù)及其機(jī)制的探討開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。且目前的研究已經(jīng)明確的證實(shí)缺氧預(yù)處理和缺血預(yù)處理具有相似的效應(yīng)。由于缺血本身是一種損傷，實(shí)施損傷性預(yù)處理臨床還難以接受，目前誘導(dǎo)預(yù)處理的研究已從缺血、生物、物理、化學(xué)源性擴(kuò)展到藥物性預(yù)處理。藥物性預(yù)處理（pharmacologic preconditioning）是通過(guò)藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)呈現(xiàn)的心臟保護(hù)作用。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）具有藥物預(yù)適應(yīng)作用。ACEI通過(guò)誘導(dǎo)或增強(qiáng)預(yù)處理早期心臟保護(hù)作用已有較多研究，而誘導(dǎo)預(yù)處理的延遲保護(hù)作用的報(bào)道不多；因此，為了研究ACEI晚期預(yù)處理在血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中建立血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注（缺氧復(fù)氧）損傷模型，選用卡托普利（ACEI代表藥，非前體藥），探討卡托普利和Caspase-3、8、9在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用。我們把人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為正常對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組、和卡托普利預(yù)處理組；分別進(jìn)行缺氧2小時(shí)復(fù)氧1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)；用免疫組化檢測(cè)Caspase-3、8、9表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺氧/復(fù)氧組隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)， Caspase-3、9表達(dá)亦隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)行性增加，尤以復(fù)氧4小時(shí)最為明顯；而Caspase—8表達(dá)無(wú)明顯變化。.卡托普利預(yù)處理組的Caspase蛋白表達(dá)變化與缺氧/復(fù)氧組相似，但明顯下降，并且細(xì)胞的Caspase蛋白表達(dá)隨著卡托普利的濃度的增加而

摘要:目的 觀察曲美他嗪治療不穩(wěn)定型心絞痛的臨床療效。 方法 120例不穩(wěn)定型心絞痛病人隨機(jī)分為治療組(60例)與對(duì)照組(60例)。對(duì)照組給予硝酸酯類藥物、阿司匹林、他汀類降脂藥、β受體阻滯劑或鈣離子拮抗劑等常規(guī)治療。治療組在上述治療的基礎(chǔ)上加用曲美他嗪，每次20 mg,每日3次口服,連用14 d。結(jié)果 心電圖療效,治療組總有效率為95.0%,對(duì)照組為73.3%;心絞痛療效,治療組總有效率為93.3%,對(duì)照組為66.7%。兩組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 曲美他嗪可有效控制不穩(wěn)定型心絞痛發(fā)作,安全方便。關(guān)鍵詞:不穩(wěn)定心絞痛；曲美他嗪；1資料和方法1.1病例選擇和分組，以中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)會(huì)制定的《不穩(wěn)定心絞痛診斷和治療建議》為標(biāo)準(zhǔn)[2]，選取我院循環(huán)內(nèi)科2008年2月—2009年12月的住院患者120例，其中排除嚴(yán)重肝腎功能不全、有出血傾向或凝血功能異常、近期有手術(shù)或其他出血性疾病以及嚴(yán)重高血壓未有效控制者。將入選病例隨機(jī)分成2組：對(duì)照組60例，年齡45-75歲，男性32例，女性28例，其中初發(fā)心絞痛20例，惡化勞力型心絞痛 28例，靜息性心絞痛 7例，梗死后心絞痛5例；治療組60例，男性31例，女性29例，其中初發(fā)心絞痛19例，惡化勞力型心絞痛 27例，靜息性心絞痛 7例，梗死后心絞痛7例.治療組和對(duì)照組在年齡、性別、心絞痛類型及其危險(xiǎn)分層差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1.2方法：對(duì)照組常規(guī)應(yīng)用阿司匹林抗凝、他汀類調(diào)脂、硝酸脂類藥物擴(kuò)冠，β受體阻滯劑或鈣離子拮抗劑。治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用曲美他嗪(萬(wàn)爽力,法國(guó)施維雅藥廠)每次20 mg次20 mg,日3次口服，連續(xù)用14天。1.3觀察指標(biāo)：住院治療期間觀察記錄心絞痛的發(fā)作頻率，硝酸甘油的日使用量及常規(guī)檢測(cè)血壓，心率及心電圖。治療前后均行血尿常規(guī)及肝腎功能檢查。1.4療效判定標(biāo)準(zhǔn) 以1993年衛(wèi)生部制定的《心血管系統(tǒng)藥物臨床研究指導(dǎo)原則》為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：（1）顯效：同等勞累程度不引起心絞痛或心絞痛發(fā)作次數(shù)較少80%以上，硝酸甘油用量減少80%以上，靜息時(shí)心電圖恢復(fù)正常,；（2）有效：心絞痛發(fā)作次數(shù)及硝酸甘油消耗量均減少50%~80%，ST段下移回升≥0.05mv,但未達(dá)到正常水平，主要導(dǎo)聯(lián)的T波倒置變淺或由低平轉(zhuǎn)為直立；（3）無(wú)效：心絞痛發(fā)作頻率及硝酸甘油用量均減少不到50%，治療前后的靜息或次極量運(yùn)動(dòng)心電圖ST-T無(wú)變化。1.5資料統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 選用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，臨床療效和心電圖療效均采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 兩組心絞痛臨床療效對(duì)比（表1）表1 兩組心絞痛療效比較例(%)組別 n 顯效 有效 無(wú)效 總有效對(duì)照組 60 25(41.7) 16(26.7) 19(31.6) 42(70.0)治療組 60 39(65.0) 17(28.3) 4(6.7) 56(93.3) 注:兩組總有效率比較,P<0.05。2.2 兩組心電圖療效比較(見(jiàn)表2)表2 兩組心電圖療效比較例(%)組別 n 顯效 有效 無(wú)效 總有效對(duì)照組60 28(46.7) 15(25.0) 17(28.3) 43(71.6)治療組60 38(63.3) 18(30.0) 4(6.7) 57(95.0)注:兩組總有效率比較,P<0.05。2.3 藥物不良反應(yīng) 治療組在治療期間未發(fā)現(xiàn)與曲美他嗪相關(guān)的副作用。3 討論 不穩(wěn)定心絞痛是由于心肌需氧與供氧之間暫時(shí)失去了平衡而發(fā)生的心肌代謝障礙，有氧氧化受到抑制，一方面乳酸大量堆積導(dǎo)致酸中毒而引起使心肌收縮功能異常;另一方面三磷酸腺苷ATP產(chǎn)生不足，鈉鉀泵受到抑制，引起線粒體內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致線粒體腫脹，造成心肌細(xì)胞不可逆的損傷。因此針對(duì)心肌缺血時(shí)的代謝變化進(jìn)行治療，采取改善心肌能量代謝已成為現(xiàn)代治療冠心病的重要手段[4-5].。曲美他嗪是一種哌嗪類衍生物，它可以改變心肌細(xì)胞的有氧代謝途徑，增加ATP生成，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)通過(guò)提高氧自由基清除酶的活力減少氧自由的產(chǎn)生并抑制氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的氧化反應(yīng)，減輕其對(duì)心肌細(xì)胞的毒性，從細(xì)胞水平發(fā)揮其抗心肌缺血的藥理作用。此外，由于曲美他嗪是通過(guò)代謝效應(yīng)治療心肌缺血，從而具有不影響血液動(dòng)力學(xué)變化，不增加心肌耗氧量，不降低心肌收縮力的其他傳統(tǒng)治療無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。本研究表明傳統(tǒng)治療方法聯(lián)合曲美他嗪治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛的臨床療效、心電圖改善情況均優(yōu)于單純傳統(tǒng)治療, 且不影響心率、血壓變化,無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)出現(xiàn),無(wú)一例出現(xiàn)急性心肌梗死及猝死,因此曲美他嗪治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛安全、有效、值得臨床推廣。[參 考 文 獻(xiàn)][1] 滕堯文.曲美他嗪治療不穩(wěn)定型心絞痛的療效評(píng)價(jià)[J].中國(guó)心血管研究雜志,2005,3(3):212-213.[2] 中國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)心血管分會(huì).不穩(wěn)定性心絞痛診斷和治療建議[J].中國(guó)循環(huán)雜志,2001,16(3):227-229.[3] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì),中華心血管病雜志編輯委員會(huì).慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南[J].中華心血管病雜志, 2007,35(3): 195-205. [4] Palerini T,Sangiorgi D,M arzocchi A,et al. Impact of acute coronary syndromes on two year clinical outcomes in patients with unprotected left main coronary artery stenosis treated with drug-eluting stents[J ] Am J Cardiol 2010 ,105(2):174-178[5] Thadani U .Seletion of optimal theraphy for chronic stable angina [J] .Curr Treat Options Cardiovasc Med 2006.8(1):23-35

摘要]目的 研究卡托普利干預(yù)細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)機(jī)制。方法 本文采取文獻(xiàn)回顧的方法對(duì)卡托普利干預(yù)細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)機(jī)制作一綜述。結(jié)果 卡托普利具有抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重作用。結(jié)論 卡托普利能夠通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。[關(guān)鍵詞] 卡托普利 干預(yù) 細(xì)胞凋亡 Advances in Research of Captopril Intervening Cell ApoptosisSuTeng ZhengYang collation[Obstract] objective to investigate the function of captopril intervening apoptsis and its releavant mechanism . Method the published papers to explore the function and machanism of captopril intervening apoptosis were reviewed. Result Captopril not only can hold back but also induce cell apoptosis .Conclusion captopril regulate cell apoptosis by several mechanisms[key words] Captopril regulate apoptosis卡托普利是第一個(gè)口服有效的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，自從1981年由美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療高血壓以來(lái)，卡托普利在治療充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重構(gòu)和糖尿病腎病中取得了良好的療效。它在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中應(yīng)用范圍最廣[1]。隨著相關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)的迅猛發(fā)展和對(duì)卡托普利藥理作用研究的深入，近來(lái)人們?cè)诖罅康膭?dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)卡托普利具有抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重作用[2-7]，本文采用文獻(xiàn)回顧的方法對(duì)卡托普利干預(yù)細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)機(jī)制作一綜述。1卡托普利的藥理作用卡托普利是含有巰基（SH）的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑,它不但具有其他的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑藥理作用：（1）阻止血管緊張素II(AngII)的生成和作用；（2）保存緩激肽的活性；（3）保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞與抗動(dòng)脈粥洋硬化作用；（4）抗心肌缺血和心肌保護(hù)作用；（5）增加糖尿病病人對(duì)胰島素的敏感性；（6）阻止心血管病理性重構(gòu)，而且能通過(guò)所含有的巰基清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，起到穩(wěn)定線粒體膜的作用[8]，此外卡托普利還具有抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子，白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子的免疫學(xué)效應(yīng)[9]。2: 細(xì)胞凋亡2.1 細(xì)胞凋亡的概念及其基因調(diào)控細(xì)胞凋亡是指在一定的生理和病理?xiàng)l件下,遵循自身的程序通過(guò)啟動(dòng)內(nèi)部機(jī)制,主要是內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活,從而結(jié)束其生命的過(guò)程.目前的研究表明，細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的一種細(xì)胞死亡的特殊形式，其調(diào)控基因可分為促凋亡基因，包括野生型P53.c-myc，c-fas，c-jun，bcl-bax，ras，IC等基因；抑凋亡基因主要包括Bcl-2和突變型P53。自1972年Kerr[10]等首次提出細(xì)胞凋亡概念以來(lái), 細(xì)胞凋亡一直是近年來(lái)醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn).2.2細(xì)胞凋亡的通路細(xì)胞凋亡的通路主要有兩條,一條是死亡受體途徑[11]：死亡受體屬于腫瘤因子受體(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞內(nèi)部分含有一個(gè)死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配體是一個(gè)同源三聚體，每個(gè)三聚體分子結(jié)合3個(gè)Fas分子。一旦與三聚體的配體相結(jié)合，F(xiàn)as通過(guò)胞內(nèi)段的DD和FADD羧基端的DD之間的相互作用，募集胞質(zhì)中的銜接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas區(qū)域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增強(qiáng)，而自我剪切活化 。活化的Caspase-8釋放到細(xì)胞質(zhì)中即激活Caspase—3，引起細(xì)胞凋亡；另一條是線粒體途徑[12]：線粒體通路[2]：各種促凋亡信號(hào)如DNA損傷、生長(zhǎng)因子去除等誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，在ATP/dATP存在的情況下，細(xì)胞色素C結(jié)合到Apaf-1的WD40重復(fù)區(qū)域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-細(xì)胞上色素C多聚復(fù)合體。此復(fù)合體通過(guò)Apaf-1的氨基端的CARD與Caspase-9原域的CARD之間的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞質(zhì)的Caspase—9。Caspase—9酶原之間因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作為起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3促使細(xì)胞凋亡。3卡托普利抑制細(xì)胞凋亡3.1卡托普利抑制AngII誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡AngII對(duì)細(xì)胞凋亡有重要的影響，但作用機(jī)制較復(fù)雜，不同的細(xì)胞表現(xiàn)出不同的作用：既可以引起細(xì)胞凋亡，也可以引起細(xì)胞增生[13]，這主要與AngII和其相應(yīng)的受體AT1，AT2結(jié)合所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。Goldenberg I[14]等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AngII與其相應(yīng)的受體AT1，AT2結(jié)合并共同作用，在增加AT1，AT2受體蛋白的表達(dá)的同時(shí)并明顯上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，進(jìn)而激活caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但亦有研究表明：AT1受體和AT2受體與AngII結(jié)合而發(fā)揮的作用相反：即AT1受體與AngII結(jié)合具有促進(jìn)細(xì)胞增生的作用；AT2受體與AngII結(jié)合具有誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[15]。這與Liangxuguo[16]等應(yīng)用卡托普利和氯沙坦干預(yù)由AngII所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)內(nèi)結(jié)果相一致：氯沙坦作為AT1受體拮抗劑，雖然阻斷了AngII與AT1的結(jié)合,但對(duì)AngII所誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡無(wú)影響，從而說(shuō)明AT1受體在AngII所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中無(wú)明顯作用；而使用卡托普利能部分抑制AngII誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其可能機(jī)制為卡托普利通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，阻止了AngI轉(zhuǎn)換為AngII，從而不但使AngII所產(chǎn)生的氧自由基和炎性介質(zhì)減少，而且部分阻斷AngII與其相應(yīng)受體結(jié)合所至的細(xì)胞凋亡作用。同時(shí)，還能降低促凋亡基因表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從分子水平發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用[17]。此外還與卡托普利能減少緩激肽的降解，增加NO的分泌有關(guān)[18]。3.2卡托普利抑制氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡氧自由基可以通過(guò)直接損傷DNA，攻擊含有酶活性的蛋白質(zhì)，影響核基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這已經(jīng)在大量的實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)。同時(shí)，亦有實(shí)驗(yàn)證明用抗氧化劑或氧自由基清除劑干預(yù)氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，能通過(guò)阻止P53的激活、下調(diào)Bax蛋白的基因表達(dá)及降低Caspase-3的活性而抑制細(xì)胞凋亡[19]。而卡托普利本身含有巰基（SH），不但具有抑制微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及白細(xì)胞產(chǎn)生氧自自由基的作用，而且本身是強(qiáng)有力的氧自由基清除劑 [20]。Tambd[21]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利對(duì)缺血再灌注過(guò)程中產(chǎn)生氧自由基所至的細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，這與我國(guó)學(xué)者胡青松[22-23]研究發(fā)現(xiàn)卡托普利具有抑制羥自由基誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞凋亡的結(jié)論相一致。由此可見(jiàn)，卡托普利通過(guò)抑制和清除氧自由基的雙重作用來(lái)阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇所激發(fā)PT孔開(kāi)放，同時(shí)，卡托普利所含有巰基（SH）可使PT孔處于關(guān)閉狀態(tài)[24]，穩(wěn)定了線粒體膜電位，阻止Cyt-C及凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）從線粒體中釋放，從而阻斷細(xì)胞凋亡的線粒體途徑而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。同時(shí)卡托普利對(duì)線粒體復(fù)合體II-III質(zhì)子泵泵出速度和電子傳遞速度升高有調(diào)節(jié)作用，使質(zhì)子偶聯(lián)更緊密，從而保護(hù)線粒體的呼吸功能，改善細(xì)胞的能量代謝[25]，有效阻止氧自由基所造成的細(xì)胞內(nèi)鈣超載。3.3卡托普利阻止緩激肽降解而抑制細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證明卡托普利能通過(guò)減少緩激肽的降解，使增加的緩激肽通過(guò)與其β2受體結(jié)合,進(jìn)而激活磷酸酯酶C(PLC),產(chǎn)生的IP3使細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放而導(dǎo)致一氧化氮合酶（NOS）增加、上調(diào)結(jié)構(gòu)型一氧化氮的基因表達(dá)（ecNOS），從而增加一氧化氮（NO）的產(chǎn)生[26]。NO對(duì)細(xì)胞具有雙重作用，即在通過(guò)產(chǎn)生氧自由基介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，可以通過(guò)抑制Caspase酶活性而產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡作用，作用結(jié)果與細(xì)胞類型和NO的量有關(guān)[27]。Dimmelers[18]等實(shí)驗(yàn)證明NO能通過(guò)抑制Caspase酶活性而阻斷AngII所致的細(xì)胞凋亡作用，但Fukuok [28]等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NO能通過(guò)上調(diào)Fas及Bax的表達(dá)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此我們可以認(rèn)為卡托普利可能一方面通過(guò)適當(dāng)增加NO水平，另一方面通過(guò)其所含有巰基而清除NO產(chǎn)生的過(guò)量的氧自由基而共同發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。此外，通過(guò)緩激肽-NO 途徑可以激活蛋白激酶C，降低細(xì)胞代謝水平，降低ATP及氧的需求，改善細(xì)胞的能量代謝，阻止細(xì)胞凋亡[29]。3.4 其他最近研究發(fā)現(xiàn)卡托普利能阻斷由Fas受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡：UhalBD[4]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利通過(guò)降低肺泡上皮細(xì)胞表面的Fas和其配體（Fasl）的表達(dá)而抑制凋亡。此外Odakac Mizuochi T[30]等證實(shí)卡托普利通過(guò)干擾外周T細(xì)胞表面的Fas和Fasl之間的相互作用，并能降低凋亡過(guò)程中產(chǎn)生的Caspase-3類似物的活性而抑制凋亡。這為我們研究卡托普利在自身免疫病的應(yīng)用開(kāi)辟了新的道路。4卡托普利誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已有實(shí)驗(yàn)證明卡托普利具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Buemi M[5]等發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)中卡托普利0.23mg可以引起血管平滑肌細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，同樣Anne Mette[6]等動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)卡托普利通過(guò)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡而抑制受損傷后血管內(nèi)膜的增生狹窄。這其中的具體機(jī)制還不清楚，可能是卡托普利能降低心肌梗死后血管內(nèi)膜AngII的AT1受體的mRNA的表達(dá)[31]，從而引起AngII與AT1結(jié)和所致的細(xì)胞增生及抗凋亡作用減弱，而與AT2 受體結(jié)合所致的細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)的結(jié)果[32-33]。此外Ohwada T[34]等研究發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠血管拉傷后給予血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療，不但可以明顯增加新生內(nèi)膜eNOS的表達(dá),同時(shí)也可上調(diào)誘生型一氧化氮（iNOS）的表達(dá)，導(dǎo)致NO產(chǎn)生過(guò)多，而過(guò)多NO能通過(guò)上調(diào)Fas及Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡[28]。近來(lái)Glzzerman I[7]等在臨床上應(yīng)用ACEI治療腎移植術(shù)后病人發(fā)生的紅細(xì)胞增多癥取得了成功，并闡明其作用機(jī)制為ACEI能誘導(dǎo)腎移植術(shù)后病人Fas及其接頭蛋白FADD的mRNA表達(dá)增加,上調(diào)其蛋白表達(dá)，但對(duì)BCL-2.Bcl-xl.Bax,caspase-8.caspase-3的表達(dá)無(wú)影響，從而通過(guò)激活死亡受體途徑誘導(dǎo)祖紅細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，卡托普利對(duì)細(xì)胞凋亡所具有促進(jìn)的作用無(wú)疑有利于治療冠狀動(dòng)脈手術(shù)后的內(nèi)膜增生和再狹窄，同時(shí)也為其治療IgA腎病及糖尿病腎病提供了新的理論基礎(chǔ)。問(wèn)題和展望綜上所述，卡托普利具有抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重作用。但目前的問(wèn)題是卡托普利為什么會(huì)產(chǎn)生兩種截然不同的藥理作用。我們推測(cè)這主要取決于細(xì)胞類型，卡托普利的劑量以及機(jī)體所處病理狀態(tài)等因素，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。總之，卡托普利干預(yù)細(xì)胞凋亡的作用已經(jīng)得到了共識(shí)：卡托普利通過(guò)阻斷AngII與其受體之間的作用，減少氧自由基的產(chǎn)生，調(diào)控NO的合成，干擾Fas和Fasl之間的相互作用來(lái)激活或阻斷細(xì)胞凋亡程序，從而抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們有理由相信：通過(guò)對(duì)卡托普利抗細(xì)胞凋亡作用深入研究，無(wú)疑為探討充血性心力衰竭，缺血再灌注損傷以及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及手術(shù)后的再狹窄等帶來(lái)突破，并可推動(dòng)心血管疾病治療的發(fā)展。參考文獻(xiàn)1 蘇定馮 心血管藥理學(xué)(M) 第一版 北京 科學(xué)技術(shù)出版社 2001,241-2492 LihlSuzukj J, Bayna E，Zhang FM et，al。Lipopolysaccharide induces apoptosis in adult rat ventricular myocytes via 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