北京高博博仁醫(yī)院

經(jīng)常有患者甚至醫(yī)生這樣說，患者殘留30%，基因60%，怎么辦？或者說患者骨髓白血病8%，殘留0.01%，TEL-AML1 0%怎么辦？以上表明他們沒有明白殘留白血病的含義。殘留白血病又簡稱為MRD（微小殘留白血病，minimal residual disease)，是指用形態(tài)學(xué)方法檢測不出白血病細(xì)胞，而用更敏感的方法檢測得出得白血病，稱為MRD。根據(jù)這個定義，MRD必須是明確的白血病, 而且很少量（一般小于5%），不是形態(tài)學(xué)查得出來的，所以形態(tài)學(xué)報告的原始細(xì)胞不叫殘留白血病, 白血病細(xì)胞超過5%也不叫MRD。檢查MRD的方法主要包括流式細(xì)胞檢查方法，融合基因定量，變異基因深度測序定量，IGH或TCR深度測序定量等。所以我們在描述MRD應(yīng)該說什么方法檢測出的。前述一些患者甚至醫(yī)生把流式技術(shù)檢查出的白血病稱為MRD，基因定量檢查出的白血病不叫MRD是錯誤的。由于形態(tài)學(xué)是人眼識別的，不同醫(yī)院，不同技術(shù)人員識別白血病的誤差很大；急性白血病表現(xiàn)為原始幼稚細(xì)胞增加，但是原始幼稚細(xì)胞不等于白血病細(xì)胞，所以治療達(dá)到完全緩解后不能僅憑原始幼稚細(xì)胞來反映白血病細(xì)胞，因?yàn)樵技?xì)胞可以為正常細(xì)胞，每個人都有正常的原始細(xì)胞。比如一個患者治療后骨髓原始淋巴細(xì)胞為8%，流式檢查未發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞，我更相信流式的報告，白血病細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)。但是流式細(xì)胞檢測白血病與儀器校準(zhǔn)、試劑配合、分析的技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)關(guān)系很大，而且流式發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞小于0.1%時，需要分析很多的細(xì)胞和很好的技術(shù)，所以流式報告的MRD，尤其小于0.1%時，要謹(jǐn)慎相信。比如一個患者為急性淋巴細(xì)胞白血病伴TEL-AML1融合基因，治療后流式檢測MRD為0.02%，多次TEL-AML1為陰性，我更相信TEL-AML1定量結(jié)果，因?yàn)榛蚨咳绻噭┘皺z測方法好，更少受分析技術(shù)人員個人經(jīng)驗(yàn)的影響。MRD是反映白血病多少的很重要指標(biāo)，但不是唯一的，因?yàn)镸RD一般檢測的是骨髓及血液中白血病細(xì)胞，不能反映骨髓外的白血病細(xì)胞，所以對一些髓外白血病高?；颊?，如初治時白細(xì)胞高，急性T淋巴細(xì)胞白血病，曾經(jīng)發(fā)生過髓外白血?。ㄈ绮G丸，腦脊液，某處腫塊）等，要注意檢測髓外白血病，才能更好的判斷預(yù)后。

世紀(jì)60年代，在慢性粒細(xì)胞白血病患者中發(fā)現(xiàn)的費(fèi)城染色體，拉開了人類研究融合基因與癌癥關(guān)系的序幕，對白血病患者而言，融合基因的檢測又有什么意義呢？一什么是融合基因？融合基因是由2個以上基因的編碼區(qū)相連，置于相同序列的調(diào)控下構(gòu)成的嵌合基因。據(jù)報道，白血病涉及至少數(shù)十種融合基因，已經(jīng)認(rèn)識到大部分的白血病中存在著染色體結(jié)構(gòu)畸變，包括缺失、重復(fù)、倒位、易位等，進(jìn)而導(dǎo)致原癌基因及抑癌基因結(jié)構(gòu)變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白。當(dāng)一些充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子的基因發(fā)生變異時，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡的功能發(fā)生改變，同時下游信號傳遞路徑的改變將會造成細(xì)胞增殖能力的增高、分化及凋亡產(chǎn)生障礙，形成白血病表型。二白血病患者檢測融合基因有什么意義？1、診斷分型隨著白血病融合基因的發(fā)現(xiàn)及分子技術(shù)的進(jìn)步，基因檢測在白血病的診斷中意義很大。有些融合基因已經(jīng)作為診斷不同類型白血病的分子生物學(xué)特異性標(biāo)志。例如，如BCR-ABL融合基因，是第一個被確定為導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的融合基因，其出現(xiàn)在95%以上的慢性粒細(xì)胞白血病(CML)。目前，常見的臨床白血病融合基因有以下幾種。1）BCR-ABL融合基因通過t（9 ；22）（q34 ；q11）形成。約95%以上的慢性髓細(xì)胞白血病患者和20%的急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL）患者表達(dá)BCR-ABL基因，因此 BCR-ABL 融合基因可用作慢性粒細(xì)胞白血病的分子診斷標(biāo)志物。2）PML-RARA 融合基因通過t（15 ；17）（q22 ；q22）形成。PML-RARA 是 APL的特異性分子標(biāo)志 。3）AML1-ETO融合基因通過t（8 ；21）（q22 ；q22）形成。AML1-ETO主要發(fā)生于M2型白血病，是其重要的分子標(biāo)志 。4）TEL-AML1融合基因通過t（12 ；21）（p13 ；q22）形成。TEL-AML1是兒童前B-ALL最常見的染色體異常之一。5）E2A-PBX1融合基因通過t（1 ；19）（q12 ；p22）形成?？勺鳛锳LL診斷的分子標(biāo)志物，輔助預(yù)后判斷和治療指導(dǎo) 。6）ML中MLL基因經(jīng)常發(fā)生重排形成融合基因，種類較多，如t（11 ；4）（q23 ；q21）形成的 MLL-AF4。2、輔助治療和評估預(yù)后通過基因檢測，在早期的診斷中，及時明確基因位點(diǎn)可以作為靶點(diǎn)治療的參考。例如，費(fèi)城染色體是人類第一個被確定和腫瘤有關(guān)的染色體異常，格列衛(wèi)（伊馬替尼）是第一個人類設(shè)計并獲得成功的小分子靶向治療藥物，其是被FDA批準(zhǔn)用于治療頑固性或復(fù)發(fā)性 Ph+（費(fèi)城染色體陽性）ALL患者的一線藥物。3、白血病微小殘留病監(jiān)測白血病微小殘留?。∕RD）是急性白血病難治和復(fù)發(fā)的根源，能夠準(zhǔn)確的盡早診斷出MRD, 是預(yù)防白血病復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。如何才能檢測MRD？臨床上主要通過流式細(xì)胞計數(shù)法和PCR技術(shù)，而通過PCR檢測靶基因主要是白血病特異性染色體異位產(chǎn)生的融合基因。三常用的融合基因檢測方法有哪些？用于臨床白血病相關(guān)融合基因測定的實(shí)驗(yàn)方法有很多種，包括熒光原位雜交技術(shù)( FISH) 、實(shí)時定量 ＲT-PCＲ、巢式ＲT-PCＲ、多重 ＲT-PCＲ + 寡核苷酸芯片檢測等。與傳統(tǒng)的方法相比，近年來興起高通量測序方法研究基因融合的分辨更高。四融合基因檢測是查外周血還是骨髓？無論是外周血還是骨髓穿刺檢查，都可以進(jìn)行融合基因檢測。

血液病是一種嚴(yán)重危害人類健康的重點(diǎn)疾病，隨著血液學(xué)的不斷進(jìn)步，聯(lián)合化療策略、特異性靶向治療、造血干細(xì)胞移植技術(shù)的不斷提高，惡性血液病患者的生存狀況得到了顯著改善。但是，患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞負(fù)荷、腫瘤的原發(fā)耐藥等諸多原因仍使部分患者在取得完全緩解(CR) 后會出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)，CR后復(fù)發(fā)是目前困擾惡性血液病治愈的難題之一。越來越多的研究證實(shí)了微小殘留病( minimal residual disease，MRD) 與惡性血液病的復(fù)發(fā)有高度相關(guān)性?！拔⑿埩舨?MRD)”到底是什么呢？微小殘留病(MRD)是指在白血病經(jīng)誘導(dǎo)化療獲完全緩解后或是骨髓移植治療后，體內(nèi)仍殘留有少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)。它是白血病復(fù)發(fā)的首要原因，MRD的定量檢測對于判斷白血病病情有重要的臨床意義。一、檢測微小殘留?。∕RD）對白血病患者來說有什么意義呢？目前，很多白血病患者在緩解后，復(fù)發(fā)的可能性較大，定期檢測微小殘留白血病是很有必要的。檢測微小殘留白血病的意義：(1) 有利于更早地預(yù)測白血病的復(fù)發(fā)；指導(dǎo)白血病的臨床治療，根據(jù)體內(nèi)白血病細(xì)胞多少以決定是繼續(xù)化療抑或停止治療；白血病完全緩解后的治療的最終目的是清除患者體內(nèi)所有的白血病細(xì)胞，使患者得以長期無病生存并獲治愈。根據(jù)患者體內(nèi)微小殘留病變的檢測結(jié)果，可有的放矢地制定治療方案，既可避免過度治療(特別是過量化療產(chǎn)生的嚴(yán)重的毒副作用)，又可根據(jù)殘留白血病細(xì)胞數(shù)量制定有效治療方案，是個體化治療的極好依據(jù)；(2) 有利于較早發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞是否耐藥，并依此指導(dǎo)臨床選用更敏感、更具殺傷力的治療措施；(3) 有助于評價自體造血干細(xì)胞移植的凈化效果。二、微小殘留病（MRD）的檢測方法有哪些？采用靈敏度高、特異性強(qiáng)及穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)方法對白血病患者進(jìn)行定期MRD檢測，對于評估疾病狀態(tài)、判斷療效、預(yù)測復(fù)發(fā)、指導(dǎo)治療具有重要臨床意義。常用的檢測方法包括：染色體核型分析、熒光原位雜交（ FISH）、流式細(xì)胞儀（FCM）、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，免疫熒光等。相關(guān)研究表明，適合于急性白血病MRD檢測的技術(shù)敏感度至少需要達(dá)到10-4，即在10000個正常細(xì)胞中可以檢出1個白血病細(xì)胞。因此，目前臨床應(yīng)用較多的殘留檢測方法是多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RQ-PCR) 。多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)( FCM) 是基于對腫瘤細(xì)胞特殊表達(dá)的免疫表型( LAIP) 進(jìn)行識別來定量檢測MRD。RQ-PCR技術(shù)是常用的靈敏度較高的MRD檢測方法，檢測細(xì)胞水平達(dá)10-6，可對含有融合基因、突變基因和異常表達(dá)基因的亞型進(jìn)行精確檢測，但是僅對具有特異性分子生物學(xué)異常的患者適用，對于大部分發(fā)病時無特異的分子生物學(xué)標(biāo)記可供檢測的患者，RQ-PCR 檢測MRD受到限制。由于此類患者異質(zhì)性明顯，預(yù)后差別大，應(yīng)有更適合的檢測指標(biāo)對其危險度進(jìn)行分層。因此，具體哪一種檢測方法適用于患者，需根據(jù)具體情況具體分析，遵醫(yī)囑進(jìn)行檢查。三、微小殘留病（MRD）檢測的時間點(diǎn)與頻率是？由于白血病的遺傳學(xué)背景、生物學(xué)特性不同，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖動力學(xué)不一致，因此不同類型的白血病從分子水平復(fù)發(fā)到血液學(xué)復(fù)發(fā)所需的時間也不盡相同。所以，建議根據(jù)疾病的不同類型和遺傳學(xué)特征制定個體化的檢測頻率。另外，在不同病種、不同年齡和不同治療方案下，疾病緩解的持續(xù)時間是不同的。同時，由于不同類型惡性血液病的細(xì)胞起源、遺傳學(xué)背景、生物學(xué)特征、藥物敏感性等因素的影響，化療后不同時期，骨髓和外周血中腫瘤細(xì)胞的清除速率存在不同程度的差異。因此，根據(jù)患者的病情特點(diǎn)以及治療措施，在合適的時機(jī)選擇合適的標(biāo)本及恰當(dāng)?shù)臋z測手段檢測白血病微小殘留尤為重要。比如急性白血病，MRD檢測時間點(diǎn)與預(yù)后判斷具有相關(guān)性?；熀蟛煌瑫r間點(diǎn)的MRD檢測對于預(yù)后的指導(dǎo)意義不同，大致可分為早期和晚期兩個階段。第一階段為誘導(dǎo)治療后MRD監(jiān)測，用于指導(dǎo)早期危險度分層和下一步鞏固治療策略的選擇；第二階段為鞏固治療后MRD監(jiān)測，用于指導(dǎo)維持治療的強(qiáng)度以及出現(xiàn)MRD水平復(fù)發(fā)時的挽救治療策略。對于AML而言，在誘導(dǎo)治療后、鞏固治療后、移植前以及移植后的任何時間點(diǎn)的MRD陽性都有不同程度的預(yù)后價值，一旦出現(xiàn)陽性即意味著治療不是完全有效并且預(yù)示復(fù)發(fā)的風(fēng)險增大。而對于ALL而言，化療后早期（3個月內(nèi)）MRD陰性提示預(yù)后好，早期MRD≥10-2或10-3提示預(yù)后不良；在化療后期（鞏固治療后、再誘導(dǎo)后及維持治療的前期）任何水平的MRD陽性都提示預(yù)后不良。惡性血液病的治療成功取決于精確診斷、動態(tài)監(jiān)測和精準(zhǔn)治療。MRD水平不僅有助于對患者進(jìn)行危險度分層、調(diào)整治療方案，而且是判斷患者預(yù)后及預(yù)測復(fù)發(fā)的一個有效因子，隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)等技術(shù)的廣泛展開，MRD的檢測方法得到了較快的改進(jìn)，MRD監(jiān)測在惡性血液病的臨床價值將越來越多的體現(xiàn)，因此，謹(jǐn)防白血病“卷土重來”，要重視微小殘留病監(jiān)測。