腫瘤科

摘要：論述腫瘤放射學(xué)中分子靶確認(rèn)的概念。闡明分子影像學(xué)、分子生物學(xué)、放射治療學(xué)等多學(xué)科的融合是實現(xiàn)這一理念的關(guān)鍵，指出實現(xiàn)這一理念過程中應(yīng)貫徹“3DS”原則。關(guān)鍵詞：診斷顯像；方法；分子生物學(xué)；腫瘤；放射療法、聚焦生物學(xué)分子生物學(xué)為疾病的診斷、治療和干預(yù)開拓了嶄新視野。影像醫(yī)學(xué)與放射腫瘤學(xué)在技術(shù)發(fā)展領(lǐng)域正面臨巨大機遇和挑戰(zhàn)。Robert W和 Richard K提出“分子靶確認(rèn)”（molecule target credentialing）的概念：對腫瘤特異的分子靶點成像，定義腫瘤細(xì)胞的這一分子標(biāo)記并給出治療方案，治療效果在影像上被發(fā)現(xiàn)、標(biāo)記、評估。這一嶄新的腫瘤治療理念已被用于腫瘤治療和干預(yù)中某些特定分子靶點的驗證，這將為實現(xiàn)腫瘤的個體化治療提供可能[1]。這一理念被美國國家癌癥研究中心（national cancer institute , NCI）認(rèn)為是“研究領(lǐng)域的非凡機遇”。在此基礎(chǔ)上美國放射腫瘤學(xué)教授Coleman CN提出了“通過分子生物學(xué)實現(xiàn)腫瘤影像診斷與放射治療的融合”這一思想[1]。本文旨在闡述這一思想及腫瘤放射學(xué)中的一些最新概念。同時闡明實現(xiàn)這一理念過程中應(yīng)貫徹的“3DS”原則。一 放射腫瘤學(xué)進展（一）、腫瘤放射治療的分子生物學(xué)基礎(chǔ)腫瘤放射治療中射線劑量分布不受藥理學(xué)屏障限制，其首要靶點是細(xì)胞DNA。細(xì)胞死亡主要由于射線引起細(xì)胞DNA雙螺旋不可修復(fù)性破壞所致。但放射治療靶點并不僅局限于細(xì)胞DNA。更多研究表明由于射線作用引起的細(xì)胞靶點改變還包括信號傳導(dǎo)通路改變、細(xì)胞膜改變、線粒體改變、程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期改變。盡管其中有些靶點改變是對DNA受不可修復(fù)性破壞后的反應(yīng)。進一步研究表明有些非DNA靶點如細(xì)胞膜、線粒體可能也是細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素甚至可能是射線作用的首要靶點。在近距離放療中還會出現(xiàn)旁觀者效應(yīng)：射線照射細(xì)胞的分子可經(jīng)細(xì)胞膜連接間隙或細(xì)胞外微環(huán)境轉(zhuǎn)送至周圍未被照射細(xì)胞，從而影響周圍未被照射細(xì)胞。最近研究表明很低劑量射線照射（低至2―10cGy，僅有標(biāo)準(zhǔn)單次照射劑量―20cGy的1%―5%）可引起持續(xù)的分子壓力反應(yīng)或氧生產(chǎn)增高。這些改變將引起大量潛在效應(yīng)：1、可能對決定電離輻射的細(xì)胞組織命運十分重要。2、可能會成為分子放療的重要靶點。3、可能有助于具有實質(zhì)意義新的放療技術(shù)的發(fā)展，從而設(shè)計優(yōu)化的可誘導(dǎo)靶點。（二）、腫瘤放射聚焦生物學(xué)（focused biology）聚焦生物學(xué)是指通過不同射線外照射、近距離放療、全身注射靶向放射同位素的方式實施照射使產(chǎn)生的分子事件最優(yōu)化的過程[1]。在腫瘤治療中，射線的生物學(xué)聚焦不僅包括直接的細(xì)胞殺傷，還包括聯(lián)合細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性因子作為免疫治療的輔助治療，并且誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生生物學(xué)改變，使其成為分子治療的靶點。Kanazawa等在人NKO-1腫瘤細(xì)胞研究表明，γ射線照射能增加以重組腺相關(guān)病毒（rAAV）為載體的單純皰疹病毒-胸苷激酶（HSV-tk）/ganciclovir治療系統(tǒng)的效能[2]。Hiliman等報道[3]鼠前列腺癌（RM-9）基因治療前一天予射線照射可提高基因治療療效?；蛑委熡媚[瘤疫苗為γ干擾素主導(dǎo)的組織相容性DNA質(zhì)粒載體復(fù)合體（MHC）Ⅱ型轉(zhuǎn)移啟動子和為Li蛋白設(shè)計的反義反基因結(jié)構(gòu)（RUC）。結(jié)果表明57天時，治療前一天射線照射組有43.8%腫瘤消退；僅用基因治療組無一例腫瘤消退。最后治療前一天射線照射組有50%腫瘤消退，而僅用MHC治療組為37.5%，僅用Li -RUC治療組則為14%。Hiliman等認(rèn)為基因治療前一天射線照射有助于1、射線照射誘導(dǎo)瘤周出現(xiàn)的炎性細(xì)胞參加了基因治療誘發(fā)的免疫反應(yīng)。2、射線誘導(dǎo)的凋亡導(dǎo)致腫瘤蛋白和肽類(peptides)產(chǎn)生。3、治療前一天射線照射使MHC組瘤細(xì)胞在發(fā)生凋亡前有充分的時間產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原（TAA），該抗原能使RM-9腫瘤表現(xiàn)出特異的CD8+T-細(xì)胞毒性活性。4、射線照射提高了基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和質(zhì)粒投遞后表達的持久性。但射線照射改善基因治療效果的機制和優(yōu)化療效改善的射線照射條件尚需進一步研究。對臨床和藥物開發(fā)來說，射線將可能成為一個新的至關(guān)緊要的分子靶點治療工具——通過其不是殺滅細(xì)胞而是僅僅改變其生化途徑和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。放療劑量的概念將被重新定義——放療劑量根據(jù)需要產(chǎn)生的生物學(xué)改變來確定。這同時將對放療總投照劑量的決定和放療質(zhì)量保證產(chǎn)生潛在影響。另外通過射線照射調(diào)節(jié)正常組織在治療中或治療后的反應(yīng)也正在研究中。（三）腫瘤放療過程中的相關(guān)分子靶點腫瘤放射治療中有許多分子靶點可供確認(rèn)。許多新的分子治療因子可作為放射治療的敏感子和保護子作用于這些分子靶點。Shi等報道[4]通過重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體給予endostatin（一種抗血管生成因子）能提高人直腸結(jié)腸癌模型（HT29）的放療療效。單純放療組腫瘤從200mm3生長到1000 mm3需34天，endostatin加放療組則需50天（P<0.05）。以rAAV載體給予的endostatin在體內(nèi)和體外表達均具生物學(xué)活性。除血管生成外，細(xì)胞周期、生長因子受體、凋亡、蛋白降解、信號傳導(dǎo)通路、應(yīng)急反應(yīng)同樣可作為放療敏感子的分子通路確認(rèn)。進一步認(rèn)識細(xì)胞損傷和組織纖維化的分子通路，還將有助于急慢性放射損傷的修復(fù)治療。但如何對這些相關(guān)靶點成像，通過影像進行評估尚需進一步研究。（四）分子靶點射線精確投照技術(shù)分子靶點射線精確投遞技術(shù)主要包括三維適形放療、調(diào)強放療、斷層放療、質(zhì)子放療、近距離放療、各種立體放療技術(shù)及放射免疫治療。放射免疫治療方法包括單純應(yīng)用放射同位素和將同位素附著于分子上進行系統(tǒng)性放射治療兩種，用于同位素轉(zhuǎn)運的分子可以是分子，也可能是非抗體的其他結(jié)構(gòu)如抗體片段、受體配體和微脂體。技術(shù)的進步已使射線在體內(nèi)任意位置投照成為可能[1]。放療劑量投照的精確性還要求了解每天治療的靶點在哪里，這需要每天通過固定和（或）實時成像來收集信息。例如在對前列腺癌三維適形放療和調(diào)強放療的研究表明，放療不同靶區(qū)間或同一靶區(qū)內(nèi)部常會出現(xiàn)不同程度的移位。帶有基準(zhǔn)標(biāo)記的在線照射野成像和實時CT掃描有助于消除這一誤區(qū)，實現(xiàn)放療劑量的精確投遞[1]。（五）腫瘤乏氧區(qū)的確定 目前認(rèn)為，腫瘤內(nèi)細(xì)胞的氧合狀態(tài)能影響腫瘤對治療的反應(yīng)性。腫瘤乏氧細(xì)胞的存在是影響腫瘤對射線反應(yīng)性的主要因素。如果能確定腫瘤內(nèi)乏氧區(qū)，則可對其標(biāo)記給予高劑量照射。許多技術(shù)用于乏氧區(qū)的標(biāo)定，如血氧水平依賴性MR、流量氧依賴性MR、PET、動態(tài)增強MR以及電子順磁MR、overhauser增強MR。后兩種技術(shù)正在迅速發(fā)展，有潛在非侵入性確定活體乏氧區(qū)的能力。但現(xiàn)有的方法無論哪種均有其局限性[1]。目前放射腫瘤科學(xué)計劃（ROSP）的專家們已將尋找腫瘤富氧和乏氧分子標(biāo)記作為研究啟動點。目前認(rèn)為乏氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）是腫瘤乏氧的主要調(diào)節(jié)因子，參與受不同水平乏氧調(diào)節(jié)的生理學(xué)途徑，并控制著多種靶基因。該類基因通過不同的“開關(guān)”模式產(chǎn)生不同的基因產(chǎn)物，準(zhǔn)確分析基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄蛋白的分子標(biāo)記可以確定腫瘤的乏氧狀態(tài)[1]。Loncaster等報道[5]在已知乏氧調(diào)控基因產(chǎn)物中以碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CAⅨ）與腫瘤乏氧狀態(tài)最密切相關(guān)。與Eppendorf 氧分壓測量法對照，在宮頸癌中， CAⅨ的表達與細(xì)胞乏氧呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.5。Loncaster等認(rèn)為CAⅨ表達與細(xì)胞乏氧相關(guān)系數(shù)為0.5的原因之一是CAⅨ反映的是腫瘤慢性乏氧（由于氧彌散受限引起），而Eppendorf 氧分壓測量法反映的是腫瘤急性乏氧（由于氧探針插入，使氧灌注受限引起）。并且由于該基因產(chǎn)物廣泛存在于各種類型腫瘤細(xì)胞中，而不在正常細(xì)胞中出現(xiàn)，故有希望成為腫瘤乏氧的分子標(biāo)記。但同時也應(yīng)看到要尋找恰當(dāng)?shù)姆ρ醴肿訕?biāo)記的復(fù)雜性。如HIF-1在腫瘤乏氧、非乏氧的環(huán)境均可出現(xiàn)，在非乏氧環(huán)境里該因子大部分處于失調(diào)（misregulated）狀態(tài)，但在某些惡性轉(zhuǎn)移中可處于異常的“開啟”狀態(tài)[1]。二、通過分子影像學(xué)確認(rèn)分子靶點目前腫瘤放療技術(shù)如三維適形放射治療已能克服二維放療的大部分缺點，使放療高劑量分布的立體形態(tài)和靶區(qū)相適應(yīng)，有效地減少了腫瘤周圍正常組織的放射劑量。其主要是以對腫瘤和正常組織解剖知識為基礎(chǔ)。但腫瘤放療不僅需要射線投照的精確性，尚需要射線投照的準(zhǔn)確性[1]。影像學(xué)的發(fā)展為實現(xiàn)腫瘤放射治療射線投遞的準(zhǔn)確性帶來巨大機遇。分子影像學(xué)(molecular imaging)是隨著影像醫(yī)學(xué)與分子生物學(xué)等學(xué)科發(fā)展和相互融合形成的新興研究領(lǐng)域?？蓮V義地定義為在細(xì)胞和分子水平上生物進程的體內(nèi)描述和測量。與一般的臨床影像比較，它探測的是疾病基礎(chǔ)上的分子異常，即從生理、生化水平認(rèn)識疾病，闡明病變組織生物過程的變化、病變細(xì)胞基因表達、代謝活性高低、病變細(xì)胞是否存活以及細(xì)胞內(nèi)生物活動的狀態(tài)等，并以圖像的形式從分子水平描繪正常及病變組織結(jié)構(gòu)與功能變化信息的醫(yī)學(xué)影像學(xué)。目前分子成像方法包括CT、單光子發(fā)射體層成像（SPECT）、、MR、MR波譜、正電子體層發(fā)射成像（PET）、使用新型對比劑的超聲（US）、和其他新的成像方式如：光學(xué)成像、電子順磁成像、[U1] 增強MR [1]。其中以PET、MR成像研究最多，也最有前途。（一）PET分子成像：PET分子成像是把有明確生物學(xué)效應(yīng)的示蹤劑送入人體內(nèi)，讓它參加體內(nèi)生物活動，再加以探測和顯示，由此反映體內(nèi)特定的生物活動，了解體內(nèi)的生理、生化狀態(tài)及其改變。例如上文提及的HSV-tk，其結(jié)構(gòu)與胸苷類似的核苷酸磷酸化，經(jīng)核素標(biāo)記后，可通過主動轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜進入靶細(xì)胞中滯留，靶細(xì)胞內(nèi)滯留的放射性活性物質(zhì)可用來指示HSV-tk的存在，并能被PET探測到，從而可證明外源基因的轉(zhuǎn)染和表達[6]。Wells等報道利用2-[11C] 胸腺嘧啶PET在活體測得的胸腺嘧啶攝取分?jǐn)?shù)(FRT)與在體外利用Ki-67測得的細(xì)胞增殖指數(shù)明顯相關(guān)。表明2-[11C] 胸腺嘧啶PET可用于測量活體細(xì)胞增殖。Bos等利用18F脫氧葡萄糖PET掃描了解乳腺癌中乏氧誘導(dǎo)因子1α、己糖激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運子的生化途徑，認(rèn)識到其影像表現(xiàn)及生化、分子生物學(xué)機制之間異常復(fù)雜的聯(lián)系。由于PET空間分辯率低，對組織結(jié)構(gòu)顯示有局限性，而CT能提供卓越的解剖圖像，故采用圖像融合技術(shù)——CT-PET可對PET顯示出的生理、生化信息進行精確定位，為臨床醫(yī)生提供更加全面和準(zhǔn)確的信息。（二）MR分子成像：MR分子成像因能同時提供優(yōu)異的解剖圖像和分子生物學(xué)信息，不需采用圖像融合技術(shù)，而成為影像醫(yī)學(xué)研究的又一熱點。目前，[U2] [U3] 。。典型的對比劑包括GDDTPA和氧化鐵微粒。Artemov等報道其發(fā)明一種包含兩種成分的釓基抗生素-生物素復(fù)合體用于HER-2/ neu受體MR成像，由于該對比劑是由兩個獨立的小分子組成，故較單獨的大分子成像更加容易。實驗材料采用乳腺癌HER-2/ neu受體轉(zhuǎn)基因鼠，結(jié)果表明無論是實驗動物體內(nèi)腫瘤還是HER-2/ neu表達的腫瘤細(xì)胞系（lines）T1MR均表現(xiàn)為信號增高。目前認(rèn)為HER-2/ neu受體表達與乳腺癌及其他腫瘤預(yù)后相關(guān)，是免疫治療的重要靶點。故這一研究將為相關(guān)“分子靶確認(rèn)”研究奠定基礎(chǔ)[7]。Alfke等報道在四環(huán)素反應(yīng)因子的控制下通過MR成像鑒別同源細(xì)胞酪氨酸酶報告基因的表達取得成功，作者成功建立起兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。在四環(huán)素反應(yīng)因子的控制下，相對于報告基因關(guān)閉組，報告基因表達組由于基因表達產(chǎn)生的酪氨酸酶蛋白和黑色素可被MR探測而在T1WI表現(xiàn)為較高信號。這一研究進一步證明了利用MR對基因靶點成像的可行性[8]。另外Frank等報道采用超順磁氧化鐵（SPIO）MR標(biāo)記人間葉組織干細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、鼠淋巴細(xì)胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、CG-4細(xì)胞取得成功，由于SPIO已得到FDA批準(zhǔn)，故該研究將有助于盡早在人體進行MR分子成像和靶點標(biāo)記[9]。 21世紀(jì)影像醫(yī)學(xué)的發(fā)展將從解剖學(xué)或病理學(xué)的影像時代，逐步走向分子影像時期。分子影像學(xué)將對腫瘤放射治療產(chǎn)生長期深遠的影響。三 分子靶區(qū)概念放療靶區(qū)體積包括大體靶區(qū)、臨床靶區(qū)（包括顯微病灶）和計劃靶區(qū)。Ling 等建議增加生物靶區(qū)體積的概念以包括對腫瘤內(nèi)部乏氧、增殖、PH值改變和其他特性的認(rèn)識。 Coleman CN等建議增加分子靶點靶區(qū)體積(molecular-targted target volume)的概念以定義成像標(biāo)記、治療和實時評估的分子過程[1]。在這一過程中分子標(biāo)記的確定至關(guān)重要——因為其有助于理解為何不同的成像方式在不同患者會有不同的分子標(biāo)記，一種標(biāo)記在相同的部位一位患者是正常的而另一患者則為異常。四 相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為認(rèn)識腫瘤分子影像表現(xiàn)及生化、分子生物學(xué)機制之間的聯(lián)系提供有力武器。如傳統(tǒng)的基因表達、序列測定、突變和多態(tài)性分析等研究方法只適用于少量樣品的測定，操作步驟多且費力。最新發(fā)展的微陣列技術(shù)由特異序列的基因連接在固相載體的特異位點上而成，能同時測量許多基因、蛋白，評估其生化狀態(tài)，從而認(rèn)識腫瘤惡變的動力或諸如氧化壓力之類生物學(xué)反應(yīng)的基本過程，具有高通量、微型化和自動化的特點。由于腫瘤異質(zhì)性的存在，有時需要對活檢樣本中的某個單個典型細(xì)胞進行研究，一種稱為激光捕獲顯微分離技術(shù)可滿足這一要求。RNA 敲除技術(shù)則可通過人為抑制某個基因，觀察這個基因及其產(chǎn)物缺失后所發(fā)生的異常，以了解正?；虻墓δ?。故在放射腫瘤學(xué)“分子靶確認(rèn)” 研究中不僅是放射腫瘤學(xué)、影像學(xué)和核醫(yī)學(xué)的參與，更需要多學(xué)科研究小組的配合。五 “分子靶確認(rèn)”研究中的“三Ds”原則 “分子靶確認(rèn)”為腫瘤的抑制與治療帶來巨大機遇。其關(guān)鍵在于確認(rèn)作為治療靶點所需的特異的分子途徑。為優(yōu)化治療因子，必須理解該分子途徑的生物學(xué)機制。為指導(dǎo)靶向治療，必須對分子靶點成像。利用影像學(xué)發(fā)現(xiàn)進行診斷，評估局部或系統(tǒng)性治療療效，為將影像學(xué)發(fā)現(xiàn)與治療聯(lián)系起來，還必須以對組織、腫瘤生物學(xué)機制的理解為基礎(chǔ)。這一概念使腫瘤治療擺脫了傳統(tǒng)治療模式中存在的或多或少的經(jīng)驗主義，讓治療變得更加客觀。NCI中心主任Eschenbach指出在進行該項研究時需要遵循“三Ds”原則：發(fā)現(xiàn)（discovery）、發(fā)掘(development)、實施(delivery)。用于放射腫瘤學(xué)的“分子靶確認(rèn)”研究，則分子靶點標(biāo)記類似于發(fā)現(xiàn)，分子成像類似于發(fā)掘，分子治療類似于實施，三者循環(huán)往復(fù)[1]。六 結(jié)語為在放射腫瘤學(xué)領(lǐng)域盡早實現(xiàn)這一治療理念，Coleman提出放射腫瘤醫(yī)師需要了解分子影像及其影像表現(xiàn)的生物學(xué)機制，影像診斷和核醫(yī)學(xué)醫(yī)師需要懂得怎樣使影像為放射腫瘤醫(yī)師所用。所有參加者均需要有堅實的生物學(xué)基礎(chǔ)和先進的分子生物學(xué)技術(shù)[1]。如Coleman所指出“目前放射學(xué)領(lǐng)域腫瘤診斷和治療是分離的，現(xiàn)在已是將兩者重新合二為一的時候了！” [1] 參考文獻：1. Coleman CN. Linking radiation oncology and imaging through molecular biology (or now that therapy and diagnosis have separated , it’s time to get together again!). Radiology, 2003, 228（1）: 29-35.2. Kanazawa T, Urabe M, Mizukami H, et al. Gamma-rays enhance rAAV- mediated transgene expression and cytocidal effect of HSV-tk/gancicloviron cancer cells. Cancer gene therapy , 2001, 8（1）: 99-106.3. Hiliman GG, Xu MI, Wang Y, et al. Radiation improves intratumoral gene therapy for induction of cancer vaccine in murine prostate carcinoma. Human Gene Therapy , 2003, 14（3）: 763-775.4. Shi W, Feschendorf C, Muzyczka N, et al. Gene therapy delivery of endostain enhances the treatment efficacy of radiation. Radiother Oncol, 2003, 66（1）:1-9.5. Loncaster JA, Harris AL, Davidson SE, et al. Carbonic anhydrase A(CAⅨ) expression,a potential new intrinsic marker of hypoxia: correlations with tumor oxygen measurements and prognosis in locally advanced carcinoma of the cervix. Cancer reaseach, 2001, 61（21）: 6394-6399..6. Jacobs A, Voges J, Reszka R, et al. Positron-emission tomography of vector-mediated gene expression in gene therapy for gliomas. Lancet, 2001, 358(9283): 727-729.7. Artemov D, Mori N, Ravi R, et al. Magnetic resonance molecular imaging of the HER-2/neu receptor. Cancer reaseach, 2003, 63（11）: 2723-2727..8. Alfke H, Stoppler H, Nocken F, et al. In vitro MR imaging of regulated gene expression. Radiology, 2003, 228（2）: 488-492.9. Frank JA, Miller BR, Arbab HZ, et al. Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combing superparamagnetic iron oxides and transfection agents. Radiology, 2003, 228(2): 480-487.