血液內(nèi)科

成人EB病毒相關(guān)T/NK細(xì)胞淋巴組織增殖性疾病臨床及實(shí)驗(yàn)特征張倩1張紅宇*1張文麗1鐘鳳鸞1馮佳1孟慶祥1尹為華2聶李平3北京大學(xué)深圳醫(yī)院1血液內(nèi)科，2病理科，3檢驗(yàn)科，廣東深圳，518036摘要：目的：分析成人EB病毒相關(guān)的T/NK細(xì)胞淋巴組織增殖性疾?。‥BV+T/NK-LPD）的臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查特征，探討成人EBV+T/NK-LPD早期診斷和臨床預(yù)后。方法：對(duì)2005年至2012年間于我院診斷的19例EBV+T/NK-LPD臨床病理資料進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果:男11例，女8例，中位年齡32歲；起病至確診時(shí)間平均3.5個(gè)月，中位生存時(shí)間為2.5個(gè)月。持續(xù)不明原因發(fā)熱、肝脾大、肝功能損害、間質(zhì)性肺炎為常見首發(fā)表現(xiàn)。血細(xì)胞減少出現(xiàn)在18例患者中，所有患者具有β2-MG、LDH、TNF、IL-6升高、血EBV-DNA陽性（中位拷貝數(shù)>106)。骨髓細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為異常大顆粒淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞增多或伴噬血現(xiàn)象，骨髓流式細(xì)胞檢查易見CD5、CD7缺失的T/NK淋巴細(xì)胞；骨髓活檢病理檢查10例患者可見異常淋巴細(xì)胞間質(zhì)浸潤(rùn)，6例可見少量大細(xì)胞成灶性浸潤(rùn)，免疫組化異常細(xì)胞表達(dá)為CD3+CD56+NK細(xì)胞2例，CD3+CD8+T細(xì)胞11例，CD3+CD4+細(xì)胞3例。全部病例表達(dá)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)抗原(TIA-1)和EBER。3例淋巴結(jié)活檢病理主要為反應(yīng)性增生。全部患者死于進(jìn)行性的多器官功能不全。結(jié)論：成人EBV+T/NK-LPD以發(fā)熱和肝脾大為主要臨床表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室檢查以外周血EBV-DNA持續(xù)升高，EB病毒感染T/NK淋巴細(xì)胞組織浸潤(rùn)，并有多器官進(jìn)行性損傷的炎癥反應(yīng)綜合征，臨床多預(yù)后不良，上述特征性臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查有助于成人EBV+T/NK-LPD的及時(shí)診斷。關(guān)鍵詞：EB病毒；淋巴組織增殖性疾??；T淋巴細(xì)胞；成人；臨床特征；免疫表型*通信作者：張紅宇，主任醫(yī)師. 電話：（0755）83923333－6125.E-mail： zyiqu@yahoo.com.cnClinical features and laboratory findings of adult Epstein-Barr virus associated lymphoproliferative diseaseZHANG Qian1，ZHANG Hong-Yu1*，ZHANG Wen-Li1，ZHONG Feng-Luan1，F(xiàn)ENG Jia1，MENG Qing-Xiang1，YIN Wei-Hua2，NIE Li-Ping31Department of Hematology，2Department of Pathology,3Department of Laboratory，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518036，Guangdong Province，China*Corresponding Author: ZHANG Hong-Yu，Senior Physician. Tel：（0755）83923333－6125. E-mail：zyiqu@yahoo.com.cnAbstract:ObjectiveTo summarize the clinical featuresand laboratory findings of Adult Epstein-Barr virus associated T/NK cell lymphoproliferative disease(EBV+T/NK-LPD).MethodsThe clinical datas of 19 adult patients withEBV+T/NK-LPD were retrospectively analyzed .ResultsThere were 11 males and 8 females. The median age was 32 years. The average duration from onset of symptoms to diagnosis was 3.5 months. The median survival time was 2.5 months. Unkown fever, hepatosplenomegaly, liver dysfunction and interstitial pneumonia were the main clinical features. High levels of β2-MG、LDH、TNF、IL-6,and significant increased EBV-DNA level(median level >106copies/ml) were exhibited in all the patients . Cytopenia were seen in 18 cases. Morphologically, atypical large granular lymphocytes and hemophagocytosis were common in bone marrow smears . Loss of CD5 or CD7 expression were frequently observed in T/NK lymphocytes by flow cytometry of bone marrow cells. bone marrow biopsy showed atypical lymphocytes interstitial infiltrated in 10 cases, while a few large cells infiltrated in 6. Immunohistochemistry showed the infiltrated lymphocytes were CD3+CD56+ in 2 cases，CD3+CD8+ in 11 cases and CD3+CD4+ in 3 cases . TIA-1 and EBER were positive in all biopsy specimens. 3 cases underwent biopsy oflymphonodes[L1]showed reactive proliferations of lymphocytes . All the patients died of multiorgan failure.Conclusions: The study reveals that fever, hepatosplenomegaly were the most common clinical features of adult EBV+T/NK-LPD, the bone marrow infiltration of EBV-infected T/NK lymphocytes and significant increased level of EBV-DNA were observed in all cases. Given its poor clinical outcome, these clinical and experimental features can serve as a reliable marker for the timely diagnosis of adult EBV+T/NK-LPD.Key words: Epstein-Barr virus ; Lymphoproliferative disease; T-lymphocytes; Adult; Clinical features; ImmunophenotypingEB病毒相關(guān)的T/NK淋巴組織增殖性疾病(Epstein-Barr virus associated lymphoproliferative disease ,EBV+T/NK-LPD)主要在兒童發(fā)病，成人病例極為少見。但隨著近年對(duì)該疾病的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，成年病例也逐漸增多，其臨床表現(xiàn)也具有顯著異質(zhì)性，且預(yù)后極差，例如T/NK細(xì)胞型的慢性活動(dòng)性EBV感染(chronic active Epstein-Barr virus infection, CAEBV)、蚊蟲叮咬過敏或種痘樣水皰病、EBV相關(guān)的噬血性淋巴組織細(xì)胞增多癥(EBV-HLH)等，既可以呈慢性惰性病程，也可呈明顯侵襲性。盡管2008年WHO淋巴及造血組織腫瘤分類中規(guī)范了兒童系統(tǒng)性EBV+T/NK-LPD及種痘樣水皰病的組織學(xué)診斷，但EBV+T/NK-LPD的組織學(xué)改變?nèi)狈ο鄬?duì)客觀的病理特征，病理表現(xiàn)跨越了多形性到單形性改變[1]，早期診斷極為困難。而對(duì)于那些尚未進(jìn)展至腫瘤樣組織學(xué)改變的部分病人，其診斷更需依賴于臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查。我們回顧性分析了我院在2005年-2012年間收治的19例成人EBV+T/NK-LPD，結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)其臨床和生化特征、骨髓細(xì)胞形態(tài)、骨髓活檢病理及免疫組化、外周血淋巴細(xì)胞的免疫學(xué)表型及治療結(jié)果進(jìn)行總結(jié)分析，探討EBV+T/NK-LPD的早期快速診斷方法，減少誤診、漏診，爭(zhēng)取更多的治療時(shí)間。資料與方法一般資料2005年1月-2012年12月間我院診治的EBV+T/NK-LPD患者19例（獲得性免疫缺陷或接受免疫抑制劑治療的患者以及有明確T/NK細(xì)胞淋巴瘤/白血病病理學(xué)改變者除外）。所有患者符合CAEBV [2]或EBV-HLH[3]診斷；診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2008年美國(guó)NIH的EB病毒淋巴增殖性疾病國(guó)際分類會(huì)議的建議[4]。本組病例包括年齡≥18歲，嚴(yán)重疾病病程(如高燒、肝脾腫大等)超過3個(gè)月，血清中EBV-DNA負(fù)荷(拷貝數(shù)≥102。5copies／ml)升高,有主要器官受累及的組織學(xué)證據(jù)及受感染組織中EBV+T/NK細(xì)胞數(shù)量增多。檢查所有患者于我院初次就診至開始治療前完成相關(guān)檢查。包括常規(guī)體查，鼻咽部、胸腹部CT檢查及腹部B超；血液指標(biāo)：血常規(guī)（WBC、HGB、PLT計(jì)數(shù)）、肝功能（ALT、GGT、BIL、ALB）、乳酸脫氫酶（LDH）、凝血功能（PT、APTT、FIB、TT）、血沉（ESR），血尿β2微球蛋白（β2-MG)、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細(xì)胞介素-6（IL-6）、EBV-DNA PCR檢測(cè)；骨髓檢查：骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和骨髓活檢病理及免疫組織化學(xué)，并完善了外周血和骨髓細(xì)胞的流式細(xì)胞儀免疫分型檢查，采用CD2、CD3、胞漿CD79a、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD23、CD25、CD56、CD64、FMC7、TdT、sIg的淋巴細(xì)胞單克隆抗體（COLTER，美國(guó)）進(jìn)行分析。對(duì)有皮疹、肝炎、腹瀉等表現(xiàn)的患者，以及經(jīng)上述檢查未確診的患者進(jìn)行了皮膚、肝臟及消化道粘膜活檢病理檢查，活檢標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋制片，HE染色。免疫組織化學(xué)染色單克隆抗體包括CD3、CD5、CD7、CD4、CD8、CD16、CD19、CD10、CD56、TIA、granzyme B等，所有骨髓活檢病理均完善了EBV編碼的小RNA(EBER)原位雜交(FISH)的檢測(cè)。治療在明確診斷以前所有發(fā)熱的患者均接受了抗生素治療，其中10例接受了抗病毒治療（干擾素和利巴韋林），均對(duì)治療無反應(yīng)。3例僅表現(xiàn)肌炎和肝炎的患者（CAEBV)接受了小劑量強(qiáng)的松治療（30mg/d)，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性高熱和噬血細(xì)胞綜合征的患者均接受了化療，其中8例患者采用了CHOP+L-asp（CTX 750mg/m2 d1,ADM 50mg/m2 d1, VCR 1.4mg/m2 2mg max d1, PDN 100mg d1-5, L-asp 1萬U d3、5、7、9、11、13）、6例接受EPOCH（CTX 750mg/m2 d1, ADM 50mg/m2 d1, VCR 1.4mg/m2 2mg max d1, PDN 100mg d1-5, VP16 0.1 d3-5），2例接受了HLH94/2004（Dex 10 mg/m2 daily, week 1-2，5 mg/m2 daily week 3-4，2.5 mg/m2 daily, week 5-6，1.25 mg/m2 daily, week 7. VP-16 150 mg/m2 twice weekly (week 1-2)，once weekly (week 3-8). Cyclosporin A 3mg/kg q12h (血藥濃度谷值約200mg/L) week 1-8(HLH94方案從第9周開始）等方案化療。隨訪及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析全組病例進(jìn)行隨訪至2012年12月，以總生存期(OS)作為觀察終點(diǎn)。采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)表示，單因素分析采用Fisher確切概率法。結(jié)果一般[L2]情況及臨床特征（見圖1）19例患者中男11例，女8例，年齡20－70歲，中位年齡32歲，病程2天至28月。臨床類型為CAEBV的6例，EBV-HLH的13例。在所有患者中發(fā)熱為初次就診時(shí)的主要表現(xiàn)（16/19）。有肝脾腫大的患者12例，其中B超提示有門脈增寬（>10mm)9例，淺表淋巴結(jié)腫大患者僅有3例，未發(fā)現(xiàn)有鼻咽部、韋氏環(huán)累及的患者。其它器官累及表現(xiàn)為肝炎（9/19）、間質(zhì)性肺炎（15/19，有肺部CT的影像學(xué)表現(xiàn)）、漿膜腔積液（6/19），僅有2例在疾病過程中有皮膚損害，表現(xiàn)為潰瘍結(jié)痂，患者自起病到確診平均時(shí)間為3.5個(gè)月。Figure 1.Clinical presentations at the time of diagnosis實(shí)驗(yàn)室檢查特征（見表1）血常規(guī)：僅1例患者初次就診時(shí)無血細(xì)胞減少。白細(xì)胞減少10例，中位WBC 1.9×109/L(0.1-3.8)；僅1例患者白細(xì)胞升高；HGB<10g/L 12例，中位HGB 62g/L(50-94)；血小板減少16例，中位PLT 42×109/L(4-90)。初始表現(xiàn)全血細(xì)胞減少的9例，均為EBV-HLH患者。凝血功能：出現(xiàn)凝血功能異常的患者9例，全部見于EBV-HLH患者，主要表現(xiàn)為低纖維蛋白原血癥，無出血表現(xiàn)。8例早期死亡病例在疾病進(jìn)展過程中均出現(xiàn)了凝血功能紊亂。生化及免疫學(xué)檢查：9例患者出現(xiàn)不同程度肝功能損害，表現(xiàn)為谷丙轉(zhuǎn)氨酶和轉(zhuǎn)肽酶升高。12例患者出現(xiàn)低蛋白血癥；6例EBV-HLH病例表現(xiàn)有嚴(yán)重黃疸和低蛋白血癥。高LDH、β-2MG、TNF-α、IL-6出現(xiàn)在所有的患者中。β-2MG顯著升高（>3.5umol/L)6例。EB病毒感染的檢查：所有患者外周血清EBV-DNA陽性，初次就診時(shí)均超過104拷貝/ml（中位數(shù)5.2×106拷貝/ml)。5例完善血清EBV抗體檢查，均為EA-IgG>320,但EBNA為陰性。骨髓病理活檢標(biāo)本及肝臟、皮膚、消化道粘膜活檢標(biāo)本中EBER檢測(cè)均為陽性，以大細(xì)胞為主，CD3和TIA-1抗原陽性分布一致。骨髓形態(tài)：初次就診時(shí)骨髓細(xì)胞形態(tài)檢查異常的患者占73.7%（14/19），主要表現(xiàn)為異常淋巴細(xì)胞（大顆粒淋巴細(xì)胞）增多（占有核細(xì)胞比例5.5到8.5%)、組織細(xì)胞增多伴噬血現(xiàn)象，涂抹細(xì)胞增多。異常淋巴細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為核染色質(zhì)粗，較松，核形多不規(guī)則或有瘤狀突起，核仁大而明顯，胞漿深藍(lán)可見空泡，有吞噬現(xiàn)象。初次骨髓檢查未提示明顯異常的5例患者進(jìn)行了二次骨髓檢查，均表現(xiàn)為異常大顆粒淋巴細(xì)胞增多等上述細(xì)胞形態(tài)。初始表現(xiàn)為單一白血病細(xì)胞形態(tài)的病例未包括在本病例中，但有3例病人在疾病進(jìn)展過程中出現(xiàn)了大顆粒淋巴細(xì)胞白血病的骨髓細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。流式細(xì)胞學(xué)檢查：所有患者外周血淋巴細(xì)胞亞群，6例CAEBV病例中，3例為CD3+CD8+（細(xì)胞毒T細(xì)胞）比例超過70%，2例為CD16+CD56+(NK細(xì)胞型）比例超過50%，1例為CD3+CD4+比例超過50%。13例EBV-HLH患者中10例為CD3+CD8+細(xì)胞型，1例為NK細(xì)胞型，2例為CD3+CD4+細(xì)胞型。13例EBV-HLH進(jìn)行了骨髓淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞儀表型分析，免疫表型與外周血一致，但抗原表達(dá)缺失常見。其中8例EBV-HLH患者有CD5缺失的抗原表達(dá)異常，其中4例伴有CD7缺失，1例提示為CD16+CD56+CD38+。病理檢查：（見表2）所有患者在初診時(shí)均完成了骨髓組織病理檢查：其中10例患者可見異常淋巴細(xì)胞間質(zhì)浸潤(rùn)，6例可見少量大細(xì)胞成灶性浸潤(rùn)，但病理形態(tài)難于確認(rèn)為腫瘤性生長(zhǎng)，進(jìn)一步免疫組化分析提示異常細(xì)胞分別為CD3+CD56+NK細(xì)胞2例，CD3+CD8+T細(xì)胞11例，CD3+CD4+T細(xì)胞3例；3例淋巴結(jié)活檢病理為反應(yīng)性增生。2例患者經(jīng)皮膚活檢（CD3+CD8+T細(xì)胞型1例，CD3+CD56+NK細(xì)胞型1例），肝臟活檢確診的1例（CD3+CD8+T細(xì)胞型）患者同時(shí)進(jìn)行了消化道粘膜活檢（CD3+CD8+T細(xì)胞型），均與流式細(xì)胞儀分析一致。所有病理標(biāo)本中EBER檢測(cè)均為陽性。Table 1.Laboratory findings at the time of diagnosisLaboratory findingsPatient ratioCAEBV EBV-HLHWBC<4*10^9/L1/69/13Hb<100g/L2/610/13BPC<100*10^9/L4/612/13ALT>40U/L3/66/13AST>40U/L2/66/13TBIL>19umol/L1/66/13TNF-α> N6/613/13IL-6> N6/613/13APTT>45sec0/67/13FIB<2g/L0/66/13LDH>240 U/L6/613/13ALB<35g/L4/68/13β2-MG6/613/13ALT: alanine aminotransferase. AST: aspartate aminotransferase. TBIL: total bilirubin. PT: prothrombin time. APTT: activated partial thromboplasin time. FIB: fibrinogen. ALB: albumin. LDH: lactate dehydrogenase. TNF-α: tumor necrosis factor-α. IL-6: interleukin-6. N: normal.β2-MG:β2-microglobulinTable 2. Numbers of Immunohistochemistry findings in different sitesPhenotypeClinical categoryBiopsy siteCAEBVEBV-HLHBMSkinLiverGICD4+T123///CD8+T31011111NK(CD3-CD56+)2121//BM: bone marrow.GI: Gastrointestinal mucosa療效8例EBV-HLH患者盡管接受化療但仍在1月內(nèi)進(jìn)展死亡，其中1周內(nèi)死亡4例。死亡原因包括急性呼吸窘迫綜合征、呼吸衰竭、消化道出血和不可逆的凝血功能障礙，均為原發(fā)病無法控制的多器官功能衰竭所致。2例患者接受免疫化療（HLH-94方案）原發(fā)病得到控制，并分別進(jìn)行了自體及異基因造血干細(xì)胞移植，但在移植后1年和2月后復(fù)發(fā)死亡，2例患者在病程中進(jìn)展為淋巴瘤（皮膚T/NK細(xì)胞淋巴瘤和侵襲性NK細(xì)胞白血病），分別在初次就診2年后及1月后出現(xiàn)。所有患者在治療及隨訪過程中均死亡，最長(zhǎng)生存時(shí)間28個(gè)月，中位生存時(shí)間2.5個(gè)月。不同檢查指標(biāo)對(duì)生存時(shí)間影響的分析我們分析了生存時(shí)間不足1月的高危因素，單因素包括EBV-DNA、LDH、β2-MG、TNF-α、IL-6、FIB、ALB水平。發(fā)現(xiàn)高β-2MG（>3.5umol/L)和低白血癥(<26g/L)為早期死亡的不良預(yù)后因素（P=0.000和P=0.002）。討論EB病毒（EBV)在正常人群中感染率在90％以上，大多表現(xiàn)為嬰幼兒時(shí)期的無癥狀性感染，在青少年多為自限性的感染性單核細(xì)胞增多癥，極少數(shù)可轉(zhuǎn)為慢性活動(dòng)性的EBV感染（CAEBV)[5]。EBV+T/NK-LPD通常具有CAEBV背景，部分可進(jìn)展為EBV相關(guān)的淋巴瘤[6]。EBV+T/NK-LPD早期雖有感染性疾病特征，但大多呈多系統(tǒng)損害，臨床表現(xiàn)多樣，可呈急性或亞急性，其預(yù)后已非感染性疾病性質(zhì)。成人EBV+T/NK-LPD發(fā)病極少，且預(yù)后極差，其在疾病早期呈多系統(tǒng)臨床表現(xiàn)，缺乏明確的病理組織形態(tài)學(xué)，極易誤診而延誤治療。本組病例自就診到確診的平均時(shí)間為3.5個(gè)月，多數(shù)患者已進(jìn)展至器官功能不全，因此與本病相關(guān)的臨床與實(shí)驗(yàn)特征分析在早期診斷中尤為重要。2008年EB病毒(EBV)淋巴增殖性疾病國(guó)際分類會(huì)議制定了EBV+T/NK-LPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)草案，包括嚴(yán)重疾病病程(如高熱、肝脾腫大等)超過3個(gè)月，血清EBV抗體滴度增高抗CVA-IgG>5120；抗EA-IgG≥640，或抗EBNA<2，和(或)EBV-DNA負(fù)荷(拷貝數(shù))升高，有主要器官受累及的組織學(xué)證據(jù)，如間質(zhì)性肺炎、骨髓造血細(xì)胞減少、色素膜炎、淋巴結(jié)炎、持續(xù)性肝炎或脾大，受感染組織中EBV+T/NK細(xì)胞數(shù)量增多(EBER+/LMPl+)[2]。病理診斷采納了Ohshima[1]等基于病理和分子[L3]生物學(xué)方面的資料提出的EBV+T/NK-LPD的建議分類標(biāo)準(zhǔn)，其組織可呈多形性到單形性的分級(jí)變化，但目前該病理分類在臨床使用的意義未完全確定[7]。由于缺乏典型的病理特征，診斷標(biāo)準(zhǔn)更強(qiáng)調(diào)患者的臨床與實(shí)驗(yàn)檢查證據(jù)。我們觀察到19例患者初診時(shí)多伴有不明原因的發(fā)熱、肝脾大、肝功能損害、血細(xì)胞減少等臨床特征，而淋巴結(jié)、肝臟和皮膚活檢病理形態(tài)主要為反應(yīng)性增生，無明確腫瘤性生長(zhǎng)證據(jù)；但所有患者EB病毒感染狀態(tài)明確，包括血清EBV-DNA拷貝升高和組織內(nèi)EBER陽性的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，與現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道一致[8、9]。Kimura H．等報(bào)道的82例患者表現(xiàn)中以發(fā)熱(92.7％)、肝臟腫大(79.3％)、脾臟腫大(73.2％)、肝功能異常(67.1％)、血小板減少癥(45.1％)和貧血(43.9％)常見[9]。盡管上述臨床特征無特異性，但當(dāng)除外其它多系統(tǒng)疾病后，血清EBV-DNA和組織EBER的檢測(cè)對(duì)EBV-LPD有明確的診斷意義，因而可作為早期的診斷指標(biāo)。本組病例的骨髓細(xì)胞形態(tài)均有特征性的變化，表現(xiàn)為異常大顆粒淋巴細(xì)胞增多、組織細(xì)胞增多或伴有噬血現(xiàn)象。骨髓病理常見有異形淋巴細(xì)胞的間質(zhì)浸潤(rùn)和灶狀浸潤(rùn)，當(dāng)結(jié)合免疫組化發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞主要為活化的T/NK細(xì)胞（TIA-1和GramB表達(dá))，并與EBER陽性細(xì)胞的分布一致。此外T細(xì)胞抗原表達(dá)缺失也是本病實(shí)驗(yàn)特征，其中CD5和CD7表達(dá)缺失最常見。上述病理特征盡管沒有包括在現(xiàn)有的診斷標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)，但能較好地反映這一疾病的性質(zhì)，因而也可作為疾病的診斷指標(biāo)。由于多數(shù)患者表現(xiàn)為肝脾腫大而沒有淺表淋巴結(jié)腫大，骨髓檢查較其它器官的活檢具有更高的可行性，因此綜合骨髓形態(tài)、流式細(xì)胞學(xué)及骨髓病理檢查可能對(duì)EBV+T/NK-LPD的早期診斷更有意義。LPD是一種系統(tǒng)性的炎癥性疾病，由于活化的T/NK淋巴細(xì)胞持續(xù)分泌如TNF-α,Fas-L, IL-8, IL-6等炎癥細(xì)胞因子[10、11]，造成相應(yīng)增殖組織和器官的炎癥性損傷，故初始表現(xiàn)為全身性疾病，其中最常見的累及部位是肝和脾，其次是淋巴結(jié)、骨髓、皮膚及肺等，我們檢測(cè)到所有患者的炎癥細(xì)胞因子濃度（TNF-α、IL-6）均顯著升高,與文獻(xiàn)報(bào)道相符，持續(xù)的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致器官不可逆的損傷，本組治療結(jié)果也顯示即使接受化療也未改變多數(shù)患者的預(yù)后，本組病例多因素分析也發(fā)現(xiàn)患者血清的高β2-MG水平為早期死亡的不良預(yù)后因素，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示早期診斷的重要性，以避免進(jìn)展至器官功能不全，減少治療的相關(guān)并發(fā)癥。我們觀察到的EBV+T/NK-LPD侵襲性高，預(yù)后差，多伴有發(fā)熱、肝脾大，實(shí)驗(yàn)室檢查可見血細(xì)胞減少、肝功能損害、LDH、TNF-α、IL-6升高，EBV-DNA持續(xù)升高，骨髓細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞學(xué)及骨髓病理檢查相結(jié)合可發(fā)現(xiàn)異常淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞及EBV組織內(nèi)感染的證據(jù)。在缺少明確的病理診斷依據(jù)的情況下，上述臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查相結(jié)合可能成為EBV+T/NK-LPD快速診斷的方法，從而使患者獲得較早的治療時(shí)機(jī)。參考文獻(xiàn)1、Ohshima K, Kimura H，Yoshino T，el a1．Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder(LPD)in children and young adults：overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD．Pathol Int，2008; 58(4)：209-217．2、Cohen JI. 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非霍奇金淋巴瘤患者外周血Treg細(xì)胞及IL-6、TNF-α水平的研究張倩 張紅宇* 鐘鳳鸞 張文麗 許蕾 孟慶祥北京大學(xué)深圳醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東深圳，518036*通信作者：張紅宇，主任醫(yī)師. 電話：（0755）83923333－6125.E-mail： zyiqu@163.com△ 2011深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目,項(xiàng)目編號(hào)201102028摘要：目的：通過對(duì)非霍奇金淋巴瘤患者Treg細(xì)胞及IL-6，TNF-α在疾病不同階段的水平的觀察，探索這些免疫因素在非霍奇金淋巴瘤預(yù)后中的作用。方法：將我院診治的87例NHL患者按臨床預(yù)后分為無事件生存組、復(fù)發(fā)組、難治組，另設(shè)健康對(duì)照20例，動(dòng)態(tài)觀察Treg細(xì)胞及IL-6，TNF-α在疾病不同階段的水平。結(jié)果：87例NHL患者中無事件生存組64例，復(fù)發(fā)組14例，難治組9例；初治時(shí)NHL患者外周血Treg細(xì)胞比例、IL-6、TNF-α顯著升高（P<0.05）；其中難治復(fù)發(fā)組在起病時(shí)的Treg及IL-6水平較無事件存活組更高（P<0.05），TNF-α水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。停止治療時(shí)所有NHL患者外周血Treg、IL-6、TNF-α的水平與健康對(duì)照相比無顯著差異；停止治療后3月及6月時(shí)Treg、CD4+T淋巴細(xì)胞比例有升高趨勢(shì)，復(fù)發(fā)組較無事件存活組出現(xiàn)IL-6、TNF-α升高，但上述改變均不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：Treg細(xì)胞可能在NHL發(fā)病及疾病進(jìn)展中起到促進(jìn)作用，監(jiān)測(cè)IL-6及TNF-α的表達(dá)水平對(duì)早期判斷難治病例和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)可能有重要的臨床意義。關(guān)鍵詞：非霍奇金淋巴瘤；調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞；白細(xì)胞介素-6；腫瘤壞死因子-αLevels of regulatory T cells and concentrations of interleukin-6 and tumor necrosis factor-αin peripheral blood of patients with non-Hodgkin’s lymphomaZHANG Qian，ZHANG Hong-Yu*，ZHONG Feng-Luan，ZHANG Wen-Li，XU Lei，MENG Qing-XiangDepartment of Hematology，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518036，Guangdong Province，China*Corresponding Author: ZHANG Hong-Yu，Senior Physician. Tel：（0755）83923333－6125. E-mail：zyiqu@163.comAbstract:Objective:This study was purposed to investigate the levels of regulatory T cells(Treg) and concentrations of interleukin-6(IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in peripheral blood of patients with non-Hodgkin’s lymphoma(NHL) and to explore their roles in the pathogenesis and prognosis. Methods: Eighty-seven patients with NHL were divided into three groups: events-free survival group, relapse group and refractory group ,the healthy controle group was set up as well. The levels of Treg cells and concentrations of IL-6 and TNF-α in peripheral blood of patients were analyzed during different periods. Results: There were 64 cases in the even-free groups, 14 cases in the relapse group and 9 cases in the refractory group.The levels of Treg cells and concentrations of IL-6 were significantly higher in all NHL patients, especially in relapse and refractory groups, while no difference were seen when compared with the concentrations of TNF-α.At the end of chemotherapy, the levels of Treg cells and concentrations of IL-6 and TNF-α had no difference with the healthy control group. More Treg cells and higher concentrations of IL-6 and TNF-α were seen in relapse group than event-free group at the time of 3 months or 6 months off treatment, but the difference was not statistically significant. Conclusions：Treg cells may play a key role in pathogenesis and development of NHL. IL-6 and TNF-α may become useful factors for predictor of relapse and refractory. Key words: non-Hodgkin’s lymphoma; Treg cell; IL-6; TNF-α非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma, NHL）是免疫細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中的惡性轉(zhuǎn)化，除了瘤細(xì)胞本身的基因突變獲得惡性轉(zhuǎn)化外，現(xiàn)有研究也提示宿主的免疫環(huán)境、慢性抗原刺激，與免疫輔助細(xì)胞的接觸和大量炎癥細(xì)胞因子的分泌也是惡性淋巴瘤發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[1-3]。白細(xì)胞介素（interleukin-6，IL-6）在NHL患者中升高，并認(rèn)為可能與不良預(yù)后有關(guān)[4]；在NHL中也可以觀察到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell,Treg）細(xì)胞及高分泌IL-17的CD4+輔助性T細(xì)胞（Th17）的失衡，而且在某些NHL類型中可能具有預(yù)后意義[5]。目前NHL的治療以放、化療為主，雖然造血干細(xì)胞移植及單克隆抗體的使用改善了部分侵襲性淋巴瘤的預(yù)后，但復(fù)發(fā)及難治NHL仍是淋巴瘤治療的難題，已有報(bào)道免疫調(diào)節(jié)劑通過改善腫瘤微環(huán)境和抑制炎癥因子的釋放成功應(yīng)用于復(fù)發(fā)難治NHL的治療。我們分析了我院診治的87例NHL患者，結(jié)合其臨床預(yù)后，動(dòng)態(tài)觀察了Treg細(xì)胞及IL-6，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）在疾病不同階段的水平，以探索這些免疫因素異常對(duì)NHL預(yù)后的影響及免疫調(diào)節(jié)劑治療難治淋巴瘤的可能性。1 病例和方法1.1 病例：2007年12月至2012年12月我院診治的87例NHL患者，其中男50例，女37例，中位年齡41歲（17歲-80歲）。所有患者均經(jīng)過病理學(xué)檢查確診，符合世界衛(wèi)生組織（WHO）2001年淋巴瘤分類標(biāo)準(zhǔn)。臨床資料收集從治療前開始，按照治療效果共分為3組：難治組、復(fù)發(fā)組和無事件存活組。另以同期無感染、腫瘤、自身免疫性疾病者20例為健康對(duì)照。1.2 治療：除難治、復(fù)發(fā)患者外，所有患者均已完成治療。1.3 觀察指標(biāo)：臨床特征：Ann Arbor分期、B癥狀、ECOG評(píng)分、IPI評(píng)分、結(jié)外器官受累情況、乙型肝炎病史等；免疫功能指標(biāo)：淋巴細(xì)胞亞群，輔助性T細(xì)胞Th1/Th2, 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg（CD4CD25highCD127low)；炎癥細(xì)胞因子：TNF-α、IL-6；影像學(xué)及其他指標(biāo)：CT、PET-CT等。免疫功能指標(biāo)、炎癥因子于每次治療后監(jiān)測(cè)，結(jié)束治療的患者每3月復(fù)查一次，結(jié)束治療時(shí)間為獲得完全緩解后至少3個(gè)以上療程。疾病復(fù)發(fā)為終點(diǎn)事件。1.4 檢測(cè)方法 外周血CD4+CD25highCD127low Treg百分率: 靜脈采取血樣2 mL EDTA抗凝血，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25highCD127low占CD4+T細(xì)胞的百分率。測(cè)定管加人FITC標(biāo)記的抗CD4和APC標(biāo)記的CD25各20 uL、PE標(biāo)記的CD127 20uL ，將標(biāo)本充分混勻，分別加100uL EDTA抗凝血于試管中，震蕩器上充分混勻，避光放置15 min；加入溶血素2 mL，充分震蕩，避光放置10 min。1 500 r／min離心5 min棄上清，加人生理鹽水2 mL震蕩，1 500 r／min離心5 min棄上清，加入生理鹽水500ul，充分震蕩混勻，待測(cè)。用FAC·SComp調(diào)整儀器FSC、SSC、FL1、FL2、FL3 的電壓及補(bǔ)償。用CELLQuest軟件獲取20 000個(gè)淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析。選取CD4細(xì)胞進(jìn)行分析，分別以同型對(duì)照管調(diào)整marker的位置。在同等的實(shí)驗(yàn)條件下，用以分析測(cè)定CD4+CD25highCD127low占CD4+ T細(xì)胞的百分率。(流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示例見圖1)1.5 療效評(píng)估：按照NHL的NCCN指南中療效判定標(biāo)準(zhǔn)，難治組為治療后無法獲得完全緩解（CR）、不能確定的完全緩解（CRu）或部分緩解（PR）的患者；復(fù)發(fā)組為治療獲得CR或PR后出現(xiàn)新的累及部位或原部位進(jìn)展50%以上者；治療后獲得CR或PR，無進(jìn)展的患者歸為無事件存活組。87例患者中復(fù)發(fā)組14例，病理類型包括彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤7例，套細(xì)胞淋巴瘤3例，Burkitt淋巴瘤2例，鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤1例，血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤1例。復(fù)發(fā)時(shí)間為停止治療后5月-23月，中位時(shí)間9月。難治組9例，分別為結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤3例，外周T細(xì)胞淋巴瘤2例，腸病T細(xì)胞淋巴瘤1例，肝脾T細(xì)胞淋巴瘤1例，間變大細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤1例，Burkitt淋巴瘤1例。無事件存活組64例，無進(jìn)展時(shí)間為停止治療后5月-82月，中位時(shí)間為34月。各組淋巴瘤類型詳見表1，除無事件存活組鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤2例分別為I期和II期外，所以患者的臨床分期均>=III期。表1.各組淋巴瘤類型分布無事件生存組(64例)復(fù)發(fā)組(14例)難治組(9例)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤467-套細(xì)胞淋巴瘤43-Burkitt淋巴瘤421結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤3（鼻）1（鼻）3血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤11-外周T細(xì)胞淋巴瘤3-2腸病T細(xì)胞淋巴瘤--1肝脾T細(xì)胞淋巴瘤--1間變大細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤3-11.6 隨訪：所有病例采用門診隨訪或電話隨訪，隨訪截止日期2013年3月31日。中位隨訪時(shí)間24月（3月- 82月）。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用X±SD表示，兩組間的比較采用Student t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 NHL患者起病時(shí)淋巴細(xì)胞亞群、Treg細(xì)胞及IL-6，TNF-α NHL患者在起病時(shí)淋巴細(xì)胞亞群分析與健康對(duì)照相比，NHL初治患者CD8+T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞比例顯著升高（36.2±9.2% vs 22.3±7.4%,P<0.05；21.1±10.0% vs 11.7±6.3%，P<0.05）。外周血Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比例7.9±2.9%，對(duì)照組5.9±1.6% ( P=0.0001) 。IL-6、TNF-α也較健康對(duì)照組有顯著升高(8.9±3.4 pg/ml VS 1.3±0.7 pg/ml，P<0.05；33.7±10.3pg/ml VS 9.5±5.2pg/ml,P<0.05）。2.2 難治復(fù)發(fā)組與無事件存活組在淋巴細(xì)胞亞群、Treg及IL-6、TNF-α水平的比較 難治復(fù)發(fā)組在起病時(shí)的Treg及IL-6水平較無事件存活組更高（P<0.05），CD8+T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞比例、TNF-α水平兩組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（見表2）表2. 難治復(fù)發(fā)組與無事件存活組在Treg及IL-6、TNF-α水平的比較無事件生存組復(fù)發(fā)組(P值)難治組(P值)病例數(shù)（例）64149Treg（%）4.9±1.411.6±3.2（P<0.05）13.6±4.1（P<0.05）IL-6（pg/ml）3.6±1.27.8±3.1（P<0.05）8.1±0.9（P<0.05）TNF-α（pg/ml）25.1±11.337.9±10.8（P>0.05）42.9±9.6（P>0.05）2.3 結(jié)束治療后各時(shí)間點(diǎn)（停止治療后3月、6月）復(fù)發(fā)組及無事件存活組在免疫指標(biāo)及細(xì)胞因子水平的比較停止治療時(shí)NHL患者（包括無事件存活組及復(fù)發(fā)組）外周血Treg、IL-6、TNF-α的水平與健康對(duì)照相比無顯著差異；停止治療后3月及6月時(shí)Treg、CD4+T淋巴細(xì)胞比例有升高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；復(fù)發(fā)組較無事件存活組在停止治療3月和6月時(shí)出現(xiàn)IL-6、TNF-α升高，但改變不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述復(fù)發(fā)患者在停止治療后的觀察點(diǎn)上仍處緩解狀態(tài)，由于停止治療12月后復(fù)發(fā)的患者數(shù)量?jī)H為4例，其它時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)未列入統(tǒng)計(jì)范圍。（表3）表3. 停止治療后3月、6月復(fù)發(fā)組及無事件存活組在Treg及IL-6、TNF-α水平的比較Treg（%）IL-6（pg/ml）TNF-α（pg/ml）停治療后時(shí)間0月3月6月0月3月6月0月3月6月復(fù)發(fā)組5.8±1.66.8±0.48.7±2.51.5±0.42.7±1.15.2±2.88.5±4.49.3±3.89.8±2.5無事件存活組5.4±2.15.0±1.64.2±1.61.5±0.71.9±1.11.5±0.99.2±4.110.4±4.78.9±3.7圖1: 左圖為淋巴細(xì)胞比例,選取CD4+淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析;右圖中P4為CD4+淋巴細(xì)胞中+CD25highCD127low細(xì)胞數(shù)3 討論免疫環(huán)境的平衡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。已有多項(xiàng)研究支持宿主的免疫缺陷和慢性炎癥性疾病誘發(fā)NHL的發(fā)病，NHL無論是瘤內(nèi)微環(huán)境還是外周血漿均有免疫細(xì)胞異常及炎癥因子的高表達(dá)[1,3,6]。本研究初步觀察了Treg細(xì)胞和TNF和IL-6在非霍奇金淋巴瘤外周血的表達(dá)水平。Treg細(xì)胞在維持自身免疫耐受及免疫穩(wěn)態(tài)中起重要作用；NHL的外周血及腫瘤內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞增多，在B細(xì)胞NHL、ATLL、皮膚T淋巴瘤中Treg細(xì)胞增多[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)在B細(xì)胞NHL中Treg細(xì)胞在促進(jìn)早期淋巴瘤進(jìn)展的免疫逃避機(jī)制中起主要作用，但在后期NHL中沒有觀察到上述作用。目前也認(rèn)為淋巴瘤細(xì)胞自分泌IL-2、IL-6等炎癥因子，促進(jìn)Treg細(xì)胞發(fā)育，本身具有降低宿主免疫反應(yīng)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。此外在B細(xì)胞NHL的活檢標(biāo)本內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)TH17細(xì)胞顯著減少，提示B淋巴瘤細(xì)胞可通過影響了Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞間的平衡促進(jìn)了腫瘤微環(huán)境的形成[10]。此外Treg/Th17失衡也可促進(jìn)炎癥因子的釋放進(jìn)一步促使NHL的發(fā)病。Th17細(xì)胞在IL-6、TGF-β同時(shí)存在的情況下，經(jīng)由SATA-3通路活化特異性轉(zhuǎn)錄因子孤兒核受體(ROR- t)，誘導(dǎo)初治CD4+ T細(xì)胞分化而成，分泌IL-17、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α 等多種細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥狀態(tài)[11-12]。本研究沒有動(dòng)態(tài)檢測(cè)TH-17細(xì)胞，但本次研究觀察發(fā)現(xiàn)NHL起病時(shí)外周血中Treg顯著升高（P<0.05），難治復(fù)發(fā)組更明顯，隨著病情的改善Treg下降，提示在NHL發(fā)病及疾病進(jìn)展中Treg細(xì)胞可能起到促進(jìn)作用。有研究證實(shí)化療前高水平的IL-6是疾病難治的獨(dú)立預(yù)后因素；Niistu.N在侵襲性NHL的研究中表明IL-6和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是侵襲性淋巴瘤的獨(dú)立預(yù)后因素[4]；在雙胞胎人群中HL患者及健康同胞的IL-6及其基因型測(cè)定，具有低IL-6水平的基因型者患HL的風(fēng)險(xiǎn)降低[13]。腫瘤壞死因子α（TNF-α）不僅參與腫瘤的修復(fù)，同時(shí)參與腫瘤的啟動(dòng)和增殖，也是淋巴瘤細(xì)胞自分泌細(xì)胞因子，是淋巴瘤細(xì)胞的強(qiáng)烈增殖信號(hào)。我們比較了難治復(fù)發(fā)組及無事件組免疫細(xì)胞及炎癥因子的水平，發(fā)現(xiàn)難治復(fù)發(fā)組具有更高的IL-6及TNF-α,治療過程中炎癥因子未能顯著減少者提示疾病難治，復(fù)發(fā)組在停止治療后3月及6月時(shí)有IL-6升高的趨勢(shì)（P>0.05）。NHL結(jié)束治療后IL-6及TNF-α不能持續(xù)維持在正常水平或平衡狀態(tài)可能與NHL疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)相關(guān)。提示監(jiān)測(cè)IL-6及TNF-α的表達(dá)水平對(duì)臨床早期判斷難治病例和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)有重要的臨床意義。由于我們病種的限制，本研究中觀察的病例大部分為B細(xì)胞淋巴瘤，尤以彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤為主，雖然疾病分期幾乎均>=3期，但未進(jìn)一步細(xì)分至各淋巴瘤類型及不同IPI評(píng)分進(jìn)行比較，所以可能對(duì)觀察結(jié)果造成一定程度的偏倚，尚需要累積更多的病例后分組觀察。但我們的研究仍觀察到NHL患者起病時(shí)具有Treg、IL-6升高的特點(diǎn)，這些免疫因素的異常在NHL的病程中可能起到部分促進(jìn)作用，在化療過程中或治療后由于宿主的免疫缺陷和炎癥細(xì)胞因子的持續(xù)存在，可使腫瘤表現(xiàn)難治和復(fù)發(fā)。免疫調(diào)節(jié)劑沙利度胺成功地改善多發(fā)性髓瘤和復(fù)發(fā)難治套細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后，其機(jī)制可能包括沙利度胺可通過抑制NF-κB激活通路減少炎癥細(xì)胞因子的釋放并間接提高NK細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞的活性[14-15]；抑制Treg細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而達(dá)到增加對(duì)化療的敏感性并減少疾病復(fù)發(fā)的可能性。我們對(duì)上述免疫因素的臨床觀察支持免疫調(diào)節(jié)劑可通過改善宿主的免疫環(huán)境和炎癥細(xì)胞因子濃度而有可能改善部分復(fù)發(fā)難治淋巴瘤的預(yù)后，值得進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)[1] 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患者：左腋窩經(jīng)典霍奇金淋巴瘤，檢查結(jié)果為結(jié)節(jié)硬化型：ck（-）EMA(-)cp20（+）cD79a,AIK(-).cD30(+).cD15(-)，cD21(-),IcA（-），cD21（-），bc1—6（-），Ki—67（50百分比） 有什么好的治療方案， 以及化療放療后，該注意什么北京大學(xué)深圳醫(yī)院血液內(nèi)科張紅宇：按你說的情況，病人應(yīng)屬早期霍奇金淋巴瘤，但需找淋巴瘤專科醫(yī)生嚴(yán)格分期，同時(shí)了解有無不良預(yù)后因素（7項(xiàng)），早期霍奇金淋巴瘤無不良預(yù)后因素ABVD化療2-4個(gè)療程聯(lián)合受累部位放療，早期霍奇金淋巴瘤伴不良預(yù)后因素ABVD化療至少4個(gè)療程聯(lián)合受累部位放療，中期需有PET評(píng)價(jià)。